[发明专利]一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法

权利要求书

1.一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源标记基因，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白，右臂后连接另一个外源标记基因，可指示为非基因置换而为外源基因插入的负向标记基因；

(2)构建同源修复的敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左右臂中的核酸酶识别位点均破坏，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；

(3)利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的同一基因为斑马鱼gfap基因，左臂中的核酸酶靶点为gttaagtttacttaatcggg，右臂中的核酸酶靶点为ggaatgatggatttggtcag，所述的同源臂序列如SEQ ID NO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中第1120-1821位所示；所述的正向外源标记基因为P2A-EGFP序列如SEQ ID NO：1中的第331-1113位所示；所述的反向外源标记基因为IRES2-tdTomato-pA序列如SEQ ID NO：1中的第1829-4082位所示。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。

4.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，不同敲入质粒。

5.根据权利要求2所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列；获得IRES2-tdTomato-pA的DNA片段，以pIRES2-EGFP(Clonetech)和tdTomato(来自中科院神经所)为模板，以融合序列PCR引物扩增获得IRES2-tdTomato-pA，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。

6.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的同源修复质粒是通过突变非同源末端质粒中两个sgRNA位点的PAM去序列来实现。

7.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的幼鱼为受精后3天。