[发明专利]一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，包括如下步骤：(1)利用非同源末端连制备tcf3a条件性敲除品系；(2)构建转座子介导的表达质粒标记肌肉细胞；(3)同时标记质粒和Cre mRNA注射至tcf3a的条件性敲除胚胎中实现tcf3a敲除，并通过荧光观察和评价肌肉的发育和生长。本发明可活体且条件性研究肌肉生长和发育。本发明通过制备的tcf3a条件性敲除斑马鱼，并结合特异标记快速骨骼肌肉细胞的斑马鱼，可很好的在活体实现条件性诱导后tcf3a敲除来研究肌肉生长的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法。

背景技术

斑马鱼tcf3a基因(文献中命名为E12)对于骨骼肌肉的形成非常重要(见参考文献1)。利用mylpfa基因的启动子特异标记快速骨骼肌细胞，是非常好的研究肌肉形成的活体标记方法。

目前，斑马鱼中没有针对该基因的条件性诱导的方法研究肌肉形成。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过针对tcf3a基因的操作结合肌肉细胞荧光标记，在斑马鱼中实现条件性诱导tcf3a敲除来研究肌肉发育和生长的方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，包括如下步骤：

(1)在斑马鱼tcf3a的第4个外显子两端的内含子中寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；

(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂和右同源臂中，左同源臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右同源臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因序列，包括第4个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认tcf3a条件性敲除斑马鱼；

(3)构建标记斑马鱼肌肉的表达质粒，表达质粒使用斑马鱼mylpfa启动子驱动CFP荧光蛋白表达，并在两端加入转座子序列；

(4)将上述标记质粒、Cre mRNA和tol2转座酶的mRNA共同注射至tcf3a条件性敲除品系内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定tcf3a的删除、整体表型观察和肌肉的表型观察。

进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。

进一步地，在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，tcf3a敲入质粒。

更进一步地，在步骤(2)中，sgRNA1的靶点序列为：GGACGCAGCTATCAGTGGCGT；sgRNA2的靶点序列为：GCTGGTCTAGTGCTGATCTC。

进一步地，在步骤(2)中，所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：1中的第7-563位所示，所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中的第3253-3676位所示，所述的右臂之间含有需要置换的外源基因序列如SEQ ID NO：1中的第543-2710位所示。

进一步地，在步骤(2)中，所述的构建非同源末端连接的敲入质粒的左同源臂、右同源臂，以斑马鱼基因组为模板，并在PCR引物加入酶切位点和保护碱基扩增获得；第四个外显子两个loxP位点间的序列，以斑马鱼基因组为模板，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-tcf3a_exon4-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基；可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白序列，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-myl7-DsRed-pA-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。