[发明专利]一种酶法生产丹参素的方法

权利要求书

1.一种酶法生产丹参素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：设计并优化D-扁桃酸脱氢酶(ManDH；GenBank：WP_05693439)、苯丙氨酸-4-羟化酶(PAH；GenBank：WP_012854034)和4-羟苯乙酸3-羟化酶(HpaH；GenBank：TPY_2462、TPY_2460)的基因序列，并合成所述目标基因，所述D-扁桃酸脱氢酶的基因序列如序列表SEQ IDNO.1所示，所述苯丙氨酸-4-羟化酶的基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述4-羟苯乙酸3-羟化酶的基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

步骤二：PCR扩增步骤一中D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和4-羟苯乙酸3-羟化酶的全长基因，将所得的基因片段分别连接到质粒上，转入到细胞中，细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和4-羟苯乙酸3-羟化酶的湿细胞，将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到ManDH、PAH和HpaH液体酶；

步骤三：将步骤二制得的ManDH、PAH和HpaH液体酶与浓度为1-50mM的底物苯丙酮酸混合，并加入浓度为500～1500U的过氧化氢酶、甲酸盐和浓度为0.5～3mM的辅因子NADH、浓度为0.05～0.4mM的DMPH₄、浓度为0.2～1mM的FAD，放入恒温摇床中进行催化反应，反应条件为：温度30～65℃、pH 6.0～8.0，时间8～20h，所得反应液即为含丹参素溶液；

其中，步骤三中所述ManDH、PAH和HpaH液体酶的浓度分别为5～10U、0.3～1U、20～40U；步骤三中用浓度为3～9U的甲酸脱氢酶(FDH；GenBank：EFW95288)进行NADH循环利用；步骤三中选用浓度为浓度为0.1～2mg的蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD；GenBank：NP_213022)和浓度为0.1～2mg的二氢生物蝶呤还原酶(DHPR；GenBank：WP_011172549)进行DMPH₄循环利用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和和4-羟苯乙酸3-羟化酶的编码基因还包括：

(1)序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3分别所示的DNA分子；和/或；

(2)在严格条件下与(1)所述的DNA分子杂交且编码权利要求1所述D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和和4-羟苯乙酸3-羟化酶的DNA分子；和/或；

(3)与(1)或(2)所述的DNA分子具有80％以上同源性且编码权利要求1所述D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和和4-羟苯乙酸3-羟化酶的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和4-羟苯乙酸3-羟化酶的编码基因分别来自于：嗜热菌Thermococcus barophilus、Thermomonospora curvata和Sulfobacillus acidophilus。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中选用大肠杆菌DH5α菌株的D-扁桃酸脱氢酶、苯丙氨酸-4-羟化酶和4-羟苯乙酸3-羟化酶基因序列，设计引物并克隆。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中选用大肠杆菌BL21(DE3)菌株作为蛋白表达的宿主菌。