[发明专利]一种用于宫颈癌检测的试剂盒、使用方法

说明书

本发明公开了一种用于宫颈癌检测的试剂盒、使用方法、应用。该试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断宫颈癌。经实验测试，本发明的方法具有快速、灵敏度高和特异性高等特点，能够在早期及时对人宫颈癌进行诊断，使得早期准确诊断宫颈癌成为可能，避免了医疗资源的浪费。本发明试剂盒能够显著提高早期宫颈癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)。

技术领域

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于宫颈癌检测的试剂盒、使用方法、应用，具体而言，涉及一种利用宫颈细胞DNA进行甲基化qPCR以确定一个目标基因靶点的甲基化状态来用于宫颈癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。

背景技术

宫颈癌是女性最常见的癌症之一，多发生于宫颈鳞柱交界处(移行带)。在全球范围内，估计2018年有57万例新发病例，占所有癌症死亡妇女的7.5％。而中国的宫颈癌病例占全球的28％以上，高发年龄为50—55岁。近年来，中国宫颈癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势。其中85－90％为鳞状细胞癌，余下的10－15％中多数为腺癌。宫颈癌的临床表现多不明显，或仅有类似宫颈炎的症状，容易造成漏诊；一旦出现症状，多已发展到晚期，从而丧失了最佳的治疗窗口。

多项大型研究表明，定期接受宫颈癌筛查是预防宫颈癌的最佳方法。常用的宫颈癌筛检方式主要有两种，一种是常见的宫颈细胞学检查，包括传统的巴氏涂片(Pap test)和液基薄层细胞技术(TCT)两种方式，通过观察子宫颈部的分泌物而筛查可能发生癌变的非典型细胞，以早期侦测宫颈癌；另一种则为人类乳突病毒检测(HPV testing)，即观察宫颈脱落细胞中是否存在高危HPV亚型的感染。然而巴氏涂片法因取材、制片、阅片过程中存在的问题以及传统的巴氏五级分类法等都是导致它敏感性低的原因，故临床上假阴性者多见；液基薄层细胞技术因相关设备及检查耗材价格昂贵，导致它难以普及；人类乳突病毒检测虽然具有高敏感度，却容易造成高的假阳性，会导致临床上的过度治疗和增加病人的负担。因此，临床上急需能够即时、准确，并且费用低的宫颈癌早期检测技术的出现。

DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在宫颈癌中，一些抑癌基因的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断宫颈癌的状态。在宫颈癌筛查中，由于能直接收集到宫颈的上皮细胞，因此通过分析宫颈细胞中的基因甲基化来早期诊断、检测或者筛查宫颈癌，比发生在其他器官上的肿瘤更容易操作。

发明内容

在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期宫颈癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，我们的方案可取得更高的检测特异性和敏感度，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期宫颈癌癌的检测和筛查试剂盒。

本发明的目的在于提供一种用于宫颈癌早期诊断、检测或者筛查的多基因联合检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。

本发明的第一方面在于提供一种用于宫颈癌检测的试剂盒，通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断宫颈癌。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因包括PAX1和ACTB。

在一些实施方式中，用于检测PAX1基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ IDNO:9。