[发明专利]一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用在审
| 申请号： | 202010721640.7 | 申请日： | 2020-07-24 |
| 公开（公告）号： | CN111849986A | 公开（公告）日： | 2020-10-30 |
| 发明（设计）人： | 赵金龙;朱石磊;林梓凡 | 申请（专利权）人： | 江苏集萃药康生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 211500 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 减少 crispr cas9 基因 编辑 中双链 dna 片段 串联 方法 及其 应用 | ||
1.一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中；
其中，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的温度为36.5～37.5℃，优选为37℃；
优选地，所述酶切的时间为4～8h；
优选地，所述限制性内切酶I的工作浓度为0.3～1U/μL；
优选地，所述限制性内切酶II的工作浓度为0.3～1U/μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2～10ng/μL；
优选地，所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和cas9 mRNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的工作浓度为2～8ng/μL；
优选地，所述Cas9 mRNA的工作浓度为5～15ng/μL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′；
或者，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为5′-3′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′；
或者，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为3′-5′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述酶切后双链DNA经过纯化；
优选地，所述纯化的方法为琼脂糖凝胶电泳法。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述待编辑的细胞包括小鼠受精卵。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切质粒，酶切的温度为37℃，时间为4～8h，限制性内切酶I的工作浓度为0.3～1U/μL，限制性内切酶II的工作浓度为0.3～1U/μL，得到双链DNA，使用琼脂糖凝胶电泳法进行纯化；
其中，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶；
再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，所述CRISPR-Cas9反应体系中sgRNA的工作浓度为2～8ng/μL，cas9 mRNA的工作浓度为5～15ng/μL的，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2～10ng/μL，转入小鼠受精卵中，得到基因编辑后的受精卵细胞。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法在构建CRISPR-Cas9基因编辑方法中的应用。
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