[发明专利]一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法

权利要求书

1.一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；向第二发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；将第三发酵液进一步发酵，即得含有L-哌啶甲酸的的发酵液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的制备方法为：

(1)将硫酸钴类化合物和咪唑类化合物搅拌混合，离心，所得沉淀干燥，得到纳米金属有机框架；

(2)将步骤(1)得到的纳米金属有机框架通过水与海藻酸钠混合均匀，得到掺杂凝胶的纳米金属有机框架；

(3)将步骤(2)得到的掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液混合，搅拌，得到掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架；

(4)向步骤(3)得到的掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架中滴加金属离子溶液，静置，得到多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌的微球；

(5)将步骤(4)得到的微球加入培养基中培养，搅拌；再向其中加入甜菜碱，搅拌，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的溶液中，溶剂为甲醇，硫酸钴类化合物的浓度为0.1-0.8mmol/mL，咪唑类化合物的浓度为0.5-2.5mmol/mL；所述的搅拌混合为在室温下搅拌6-36h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:10～1：30；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.05～0.25mg/mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的大肠杆菌溶液OD₆₀₀为20；掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液的体积比为1:1～5:1。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的金属离子溶液为含有亚铁离子和钙离子的水溶液，亚铁离子的浓度为20～120mmol/L，钙离子的浓度为20～120mmol/L；金属离子溶液与掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架的体积比为100:1～100:25；滴加速率为1～5滴/s；静置的时间为15～60min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，将步骤(4)得到的微球按照1g/100mL～10g/100mL培养基的比加入LB培养基中，于15～35℃下搅拌5～10min；再向其中加入100～600mg甜菜碱，于15～35℃下搅拌15～60min，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂为将多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂置于LB培养基中，37℃，100～300rpm培养3h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中氯霉素和卡那霉素的含量分别为10～40mg/L和20～60mg/L；所述的阿拉伯糖的终浓度为0.5～2.5g/L；所述的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为50～300mg/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从含有L-哌啶甲酸的的发酵液中取出多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，按其照1g/100mL～10g/100mL培养基的比加入LB培养基中，于15～35℃下搅拌5～10min；再向其中加入100～600mg甜菜碱，于15～35℃下搅拌15～60min，取出微球，即得具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，再次重复使用。