[发明专利]海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：

(一)海滨锦葵总RNA的提取：

(1)向1.5mL离心管中加入1mL RNAiso Plus RNA提取液；

(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；

(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；

(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；

(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；

(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μL RNase free ddH₂O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；

(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析

(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix进行反转录，获得cDNA；

(2)按照RACE试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；

RACE实验中用到的引物：

NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAA

NAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCC

NAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCC

NAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTCACCTTTG

(3)RT-PCR的反应体系采用25μL体系，各成分和体积如下：

PCR反应程序：

预变性：94℃ 5min；

变性：94℃ 30s，

复性50-60℃ 30s，

延伸72℃ 1-2min，从第2步开始循环30次；

后延伸：72℃ 10min；

PCR结束后，电泳观察，获得单一的扩增条带，将含有扩增条带的电泳胶切下，通过胶回收获得纯化的扩增的目的条带，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；

KvNAC基因全长1276bp，其中5`UTR328bp，3`UTR213bp，基因的ORF区为735bp，编码了244个氨基酸，该蛋白的分子量大小为28.26kD，等电点8.94；蛋白的不稳定系数为55.91，是一个不稳定的蛋白，同时其平均亲水系数为-0.848。

2.根据权利要求1所述的海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：还对海滨锦葵KvNAC基因在不同组织中表达情况进行测定；

提取了海滨锦葵幼苗的根、茎和叶中的总RNA，通过反转录获得cDNA，用荧光定量RT-PCR测定KvNAC基因在锦葵不同组织中的表达情况，KvNAC基因在根、茎、叶中均有表达，表现出一定程度的组成型表达，其中根中的表达最高，是茎段中的3倍，叶片次之；说明其作为转录因子在植物体的各个组织中均通过调节下游靶基因的表达发挥重要作用。

3.一种海滨锦葵KvNAC基因植物表达载体的构建方法，其特征是：

根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；引物序列如下：

5`端：ATGGCGTTGTACGGTGAAAAG

3`端：CTAATAAAATGGCTTCTGTAGG

选用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY-Blunt Cloning Vector载体进行连接反应，构建重组克隆载体；具体的实验操作流程参照全式金公司的pEASY克隆载体使用说明进行。