[发明专利]一种蝉花甾醇的生物发酵制备方法

权利要求书

1.一种蝉花甾醇的生物发酵制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

步骤1、根据配合比和制造量选择适当量的麸皮、木糖、果糖、甘油、尿素、鱼粉蛋白胨、KH₂PO₄、ZnSO₄、VB₂、VC；所使用的的1L培养基中主要成分包括麸皮5-55g、木糖10-50g、果糖1-40g、甘油5-45g、尿素1-4g、鱼粉蛋白胨1-4g、KH₂PO₄ 1-2.4g、ZnSO₄ 0.5-2g、VB₂ 0.01-0.4g、VC 0.1-0.6g；

步骤2、将上述麸皮、木糖、果糖、甘油、尿素、鱼粉蛋白胨、KH₂PO₄、ZnSO₄、VB₂、VC；溶解于适量的水中，装入发酵罐121℃灭菌30min；

步骤3、以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，20-32℃下培养3-7天，放置在2-10℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；

步骤4、将步骤3制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3mm×3mm大小，挑取4-6块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在100-200rpm、20-32℃摇床里培养3-7天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：蛋白胨1-16g、葡萄糖10-50g、、玉米粉15-45g、麸皮12-48g；

步骤5、将步骤4制得的液体摇瓶菌种按5-20％(摇瓶菌种液体体积与种子罐培养基的液体体积比)接种量接种到种子罐培养基，在20-32℃，通气量0-1.2/1/min(v/v/min，即通气体积/种子罐中种子液液体体积/min)，转速60-150转/min培养2-4天，制得种子罐菌种液体；其中，每1L种子罐培养基含有：蛋白胨1-16g、葡萄糖10-50g、、玉米粉15-45g、麸皮12-48g；

步骤6、采用液体发酵培养技术，将种子罐菌种按5-20％(种子罐菌种液体体积与发酵培养基的液体体积比)接种量无菌地转移到发酵培养基中，在20-32℃，通气量0-1.2/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液液体体积/min)，发酵罐搅拌转速60-150转/min下培养24-96h，制得含有蝉花甾醇的蝉拟青霉发酵液；

步骤7、将步骤6中的发酵液4000转/分离心10min获得蝉拟青霉菌丝体；

步骤8、蝉拟青霉菌丝体中蝉花甾醇的分离纯化的方法，按照下述步骤进行：

(a)步骤6制得的含有蝉花甾醇的蝉拟青霉发酵液，过滤，收集滤液；

(b)滤液减压浓缩至膏状，与30倍体积无水乙醇混合，85℃的回流提取4h，收集提取液；

(c)提取液5000r/min离心10min，收集上清液；上清液真空浓缩至膏状；

(d)膏状物用2倍体积的去离子水混匀，分别5倍体积水饱和正丁醇萃取3次，收集正丁醇项，合并，减压浓缩至干；

(e)干燥物用2被体积无水乙醇，加入5倍乙醇体积的去离子水，混合均匀，4℃沉淀18h，抽滤获得粗蝉花甾醇；

(f)粗皂苷，用2倍体积无水乙醇溶解，-20℃结晶，得到蝉花甾醇粗品。

2.一种蝉花甾醇的拮抗肾癌的片剂制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

(a)将蝉花甾醇的粉状物86份，混合均匀，加入75份玉米淀粉、45份麦芽糊精、0.5份羟丙甲基纤维素混合均匀；

(b)称取4.5份羟丙甲基纤维素，然后加入90％乙醇制成10％的羟丙甲基纤维素溶液，备用；

(c)将(a)中混合粉末加入(b)中粘合剂，14目筛网制粒；

(d)烘箱温度调至55℃，干燥3h；

(e)干燥颗粒于14目筛网进行整粒，后外加2份硬脂酸镁和2份二氧化硅，进行总混；

(f)颗粒进行压片，调整片重为0.6g/片，进行薄膜包衣，铝塑包装，即得到可以用于治疗慢性肾病和肾脏肿瘤的片剂。