[发明专利]一种皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法及应用

权利要求书

1.一种皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，选取活力较好的健康鲍鱼作为实验鲍鱼；

步骤二，对步骤一中的实验鲍鱼进行消毒处理；

步骤三，用灭菌的解剖工具将步骤二中消毒处理后的实验鲍鱼的鳃取出，放入无菌海水中，在4℃的恒温摇床中以60rpm的转速，清洗2h；

步骤四，取步骤三中清洗后的鳃，将其剪成5mm长的小段，放入含有0.1％的II型胶原酶的培养皿中消化30min；

步骤五，将步骤四中消化完成的鳃加入含有血清的培养基中终止消化，并研磨后过100μm细胞筛，收集过筛液；所述含有血清的培养基是在L15基础培养基中添加血清，该血清中包含鲍鱼灭活血清和胎牛血清；

步骤六，将步骤五中的过筛液采用的转速为1000rpm，持续时间为2min离心后，弃上清液后，用完全培养基重悬，采用完全培养基重悬时，采用800rpm的转速，离心5min，取上清，得到的细胞数量较多、呈圆形、活力较好；所述完全培养基是在L15基础培养基中添加15％胎牛血清、5％的灭活鲍血清、20.2mg/ml的氯化钠、0.54mg/ml的氯化钾、0.6mg/ml的氯化钙、1mg/ml的硫酸镁、1.8mg/ml氯化镁、100IU/ml青霉素、100μg/ml的链霉素、250μg/ml的庆大霉素、2μg/ml两性霉素B，溶解后的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌而成；

步骤七，将重悬后收集的上清液接到T25培养瓶中，在17-25℃培养箱进行培养。

2.根据权利要求1所述的皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，步骤二中对实验鲍鱼进行消毒处理的方法具体包括，用刷子把实验鲍鱼体表刷洗干净，用含消毒剂的无菌海水暂养实验鲍鱼24h；在暂养实验鲍鱼的24h中，对无菌海水采用紫外消毒灯循环系统进行灭菌处理。

3.根据权利要求1所述的皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，在步骤三中，灭菌的解剖工具所采用的灭菌方法为将解剖工具放在高压灭菌锅中121℃、30min灭菌后烘干；在步骤三中用灭菌的解剖工具将步骤二中消毒处理后的实验鲍鱼的鳃取出之前，还需要在无菌工作台中用75％的酒精将实验鲍鱼的体表擦拭干净以对实验鲍鱼的体表进行消毒。

4.根据权利要求3所述的皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，步骤三中所述无菌海水采用天然海水用0.22μm过滤器过滤后，经高压灭菌锅121℃，30min高压灭菌，经灭菌的海水中加入100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、250μg/ml庆大霉素和2μg/ml两性霉素B而得到。

5.根据权利要求1所述的皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，所述鲍鱼灭活血清的制备方法包括：选用皱纹盘鲍血窦进行取血，并在56℃温度下水浴30min后，经0.22μm滤膜过滤、除菌制成。

6.根据权利要求1所述的皱纹盘鲍鳃细胞的快速原代培养方法，其特征在于，所述步骤七中，将重悬后收集的上清液接到T25培养瓶中，在22℃恒温培养箱进行培养。