[发明专利]PCR扩增用试剂的冻干保护剂、制品及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种PCR扩增用试剂的冻干保护剂、制品及其制备方法与应用。本发明提供的PCR扩增用试剂的冻干保护剂，包括海藻糖、羟丙基‑β‑环糊精、菊糖和卡拉胶。该冻干保护剂可以显著延长PCR扩增用试剂的有效期，同时能够有效降低PCR扩增反应体系在使用时形成气溶胶的可能，提高PCR的灵敏度和准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种PCR扩增用试剂的冻干保护剂、制品及其制备方法与应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种体外控制核酸技术，其在合适的缓冲体系中，在有特异性引物、脱氧核糖核酸，合适的聚合酶以及阳离子存在的条件下，经过变性-复性-延伸的反复循环，在短时间内获得大量特定基因片段的方法。

由于PCR体系中很多组分，尤其是酶、引物探针和dNTPs等对温度均较为敏感，荧光PCR试剂在使用、保存和运输条件上要求非常苛刻。目前应用较多PCR扩增用试剂呈液体状态，稳定性较差，易失效，在2-8℃条件下保存的有效期也只有3个月左右。近年来，有不少研究者对PCR体系进行冷冻干燥处理，但由于冻干技术和冷冻干燥过程对酶的影响(如稳定性)，结果鲜有成效。并且，很多配方冻干后较难复溶，给用户使用带来了极大的不便。

在现有的药物冻干技术中，常用的冻干保护剂中作为支撑作用的辅料有糖和醇类、聚合物和氨基酸等，例如甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、蔗糖、明胶、藻酸盐、环糊精等。这些填料，虽在药品冻干中应用广泛，但PCR试剂对填料的要求与药物对填料的要求有明显不同：比如药物要求的是对身体的无害(比如无致死、致畸和致突变等)，而PCR试剂对填料的要求更注重的是对检测反应无影响(灵敏度、特异性、效期)，例如不能引进对反应有抑制的物质如阳离子、反应竞争物或抑制剂等。因此，填料在药物和PCR体系中的应用场景存在非常大的不同。

对于PCR体系的冻干，首先需要在冷冻干燥过程保持酶、dNTP和引物探针的活性，其次应考虑到填料的玻璃化转变温度(Tg’)对冷冻干燥温度条件的限制，以及保护剂的吸湿性带来的效期缩短。

有资料推测双糖的羟基能在蛋白质脱水过程中与其氢键连接及时形成水化膜，从而保护了生物大分子的高级结构及功能完整。因此糖类尤其是海藻糖和蔗糖在PCR体系的冻干中较为常见，但蔗糖容易在PCR反应的高温变性中发生美德拉反应而对检测结果造成影响，一般会导致试剂的灵敏度和均一性变差。而海藻糖有结合水，并且极易吸湿，在保存过程中冻干粉吸潮会直接影响冻干试剂的效期，而冻干试剂的稳定性，跟冻干粉残留的水分息息相关，水分越多，稳定性越差，因此单纯使用海藻糖，试剂的稳定性不会是最优的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种PCR扩增用试剂的冻干保护剂。

本发明的第二目的在于提供一种冻干PCR扩增用试剂的制备方法。

本发明的第三目的在于提供上述制备方法制备得到的冻干PCR扩增用试剂。

本发明的第四目的在于提供冻干PCR扩增用试剂的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种PCR扩增用试剂的冻干保护剂，包括海藻糖、羟丙基-β-环糊精、菊糖和卡拉胶。

进一步地，包括2-6w/v％海藻糖、0.4-2w/v％羟丙基-β-环糊精、0.05-0.20w/v％菊糖和0.005-0.020w/v％卡拉胶。

进一步地，包括4w/v％海藻糖、1w/v％羟丙基-β-环糊精、0.1w/v％菊糖和0.010w/v％卡拉胶。

进一步地，所述PCR扩增用试剂包括酶、RNA酶抑制剂、dNTPS、引物、探针和缓冲液中的至少一种。