[发明专利]一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括检测非洲猪瘟病毒的专用引物和探针，所用的专用引物和探针与非洲猪瘟病毒B646L基因保守区特定序列完全配对。本发明的非洲猪瘟病毒检测试剂盒检测敏感度高，可检出浓度为5.7拷贝/μL的目的DNA，能有效检出猪肉制品中低含量的非洲猪瘟病毒，特异性好，操作简单方便，实用价值高，特别适用于动物防疫、市场监管、海关稽查等的非洲猪瘟病毒检测。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病。不同品种及年龄的猪均易感，发病率高，致死率可达100％。该病目前没有有效的治疗措施，也没有可用的疫苗。

非洲猪瘟于1921年在非洲肯尼亚被首次发现，1957年传入葡萄牙，随后蔓延至其他欧洲国家，到1995年，除了在南撒丁岛还有流行以外，非洲猪瘟在欧洲被根除。1971年非洲猪瘟从西班牙传至南美，1984年在该地区被消灭。2007年非洲猪瘟传入格鲁吉亚并在高加索地区蔓延，迅速扩散至俄罗斯、东欧及亚洲。从2018年8月3日报告第1起非洲猪瘟疫情至今，我国已陆续报告发生170余起疫情，疫情涉及全国，防控形势十分严峻。非洲猪瘟除了导致猪只死亡和扑杀而产生的直接经济损失外，还会引起巨大的经济和社会影响，包括猪及猪肉制品限制调运、猪肉制品供给不足、屠宰交易限制、众多从业人员失业、养殖户返贫以及国际贸易限制等。

非洲猪瘟病毒是一种二十面体的双链DNA病毒，其基因组大小为171kb～193kb，编码151～186个基因。其主要衣壳蛋白p72由B646L基因编码。根据B646L基因部分序列差异，将全球的非洲猪瘟病毒分为24种基因型。传入我国并造成流行的非洲猪瘟病毒属于基因II型。

用于非洲猪瘟病毒病原检测的方法主要有病毒分离、抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、荧光PCR、核酸恒温扩增法等。荧光PCR检测方法具有快速、敏感、特异、通量高等优点，广泛用于非洲猪瘟病毒的检测。研究者报道了基于B646L基因的荧光PCR方法(King et al,2003)，但是申请人发现该方法在检测香肠、肉馅、环境拭子等病毒含量较低的样品时，敏感性较差。有必要建立更加敏感的检测非洲猪瘟病毒的荧光PCR方法。

发明内容

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，本发明提供的试剂盒基于聚合酶链式反应技术，可以快速检测非洲猪瘟病毒。

本发明首先提供一种检测非洲猪瘟病毒的分子标记，所述的分子标记的核酸序列如下：

5'-CGTTCTCCGGGGTATTCGCAGTAGTAAACCAAGTTTCGGTACGCATTCTTTGTGCCGGGBACAATRGGYCTYCCAAARGGATCYACAAGCGTGTAAACGGCGCCCTCYAARGGTGTTTGGTTGTCCCAGTCATATCCGTTGCGAGGAAACGTTTGAAGC-3'(SEQ ID NO:1)；

序列中兼并碱基B代表碱基T/G/C；R代表碱基G/A；Y代表碱基C/T。

本发明还提供用于检测上述分子标记的引物和探针。

所述引物对由引物P72F3和引物P72R3组成，其序列信息如下：

引物P72F3：5′-GTTTCGGTACGCATTCTTTGTG-3′(SEQ ID NO:2)；

引物P72R3：5′-CGGATATGACTGGGACAACCA-3′(SEQ ID NO:3)；

所述探针P72P3的核苷酸序列如下：