[发明专利]一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法

说明书

本发明提供了一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法，属于细胞染色技术领域，包括：将梨果实在维生素C溶液中切片，得到梨果实片；将梨果实片淹没在染色反应溶液中2～5h，得到浸泡梨果实片；所述染色反应溶液的组分包括二氨基联苯胺或硝基四氮唑；将浸泡梨果实片脱色剂脱色后，经固定液封片。本发明区分度高，能准确、方便、有效的区分梨果肉薄壁细胞和石细胞。安全系数高，不涉及危化品，没有刺激性气味。维生素C有效地减轻切片的褐化现象，防止显色颜色干扰。能够高效观察石细胞发育过程形态结构特征并可区分石细胞含量及大小不同梨品种。

技术领域

本发明属于细胞染色技术领域，尤其涉及一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法。

背景技术

梨是我国重要落叶果树之一，栽培历史悠久、分布广泛、资源丰富。石细胞是木质素在梨果实薄壁细胞的细胞壁上沉积引起细胞壁发生次生加厚而形成的，梨石细胞的含量是梨果实品质的一个决定性因素。因此，研究梨石细胞的形态、分布及组织定位意义重大。

前期研究表明，梨石细胞形成过程是一个细胞程序性死亡的过程，细胞发生凋亡的时期与活性氧的积累密切相关，而活性氧在木质素聚合和沉积过程中起关键作用。植物NADPH氧化酶，又称呼吸爆发氧化酶(RBOH)，它催化O₂和NADPH产生O₂^-、NADP⁺和H⁺，随后O₂^-可作为超氧化物歧化酶(SOD)的底物催化生成H₂O₂和O₂。H₂O₂和O₂分别作为过氧化物酶(POD)和漆酶(LAC)的第二底物参与木质素单体聚合。最后，POD和LAC活化木质素单体自由基，使其聚合形成木质素。由此推测，活性氧在梨果实中可能仅在石细胞中大量积累,通过对活性氧进行染色，从而对石细胞进行定位。

目前常规的Wiesner法都只是对木质素进行染色，这使石细胞以及果皮、果肉、果核、果柄等部位的木质素都会被染色，造成背景干扰。这种染色方法，不但容易褪色、成本高，而且使用的试剂如：浓盐酸、浓氨水、高锰酸钾等都属于危化品，一旦吸入对呼吸道等部位损害严重，不小心接触到会灼伤皮肤，腐蚀皮肤，而且强酸强碱也会加速梨果肉褐化。因此，需要一种准确、简便、快速、安全、特异性强的方法定位梨果实石细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法，包括以下步骤：

1)将梨果实在维生素C溶液中切片，得到梨果实片；

2)将所述步骤1)得到的梨果实片淹没在染色反应溶液中2～5h，得到浸泡梨果实片；

所述染色反应溶液的组分包括二氨基联苯胺或硝基四氮唑；

3)将所述步骤2)得到的浸泡梨果实片脱色剂脱色后，经固定液封片。

优选的，所述步骤2)染色反应溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.4～0.6g/L。

优选的，所述步骤2)染色反应溶液中硝基四氮唑的浓度为0.4～0.6g/L。

优选的，所述步骤2)浸泡在避光条件下进行。

优选的，所述步骤1)维生素C溶液中维生素C的浓度为0.04～0.06g/L。

优选的，所述步骤1)梨果实片的厚度为2～4cm。