[发明专利]一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用

说明书

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862为一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36862，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述对接蛋白突变体适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑4M的条件与黏连蛋白相互作用；进一步的适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑6M的条件与黏连蛋白相互作用；适用于细胞内环境中与黏连蛋白相互作用；解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下无法自组装的问题。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用。

背景技术

纤维小体是一种可以组织、协调多种酶组分协同高效催化降解木质纤维素的天然多酶自组装体系，纤维小体主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白(dockerin，Doc) 和含有结构蛋白的粘连蛋白(cohesin，Coh)，在宽泛意义上后者又可被称为脚架蛋白。纤维小体作为一种天然、高效的多酶自组装体系，目前已在细菌、酵母等多种微生物中成功实现了胞外表面展示，并通过在Doc和Coh上利用融合酶的技术融合连接不同功能的蛋白质或酶，利用Doc和Coh相互吸引组装的原理，构建多种蛋白质或酶相互靠近的多酶复合体，缩短了物质在酶与酶之间传递的距离，进而提高了多酶串联反应的反应效率，在生物质降解、乙醇和2,3-丁二醇合成、生物传感器等多个领域实现应用[Bule,Journalof Biological Chemistry, 2016,29；Liang,AppliedEnvironmental Microbiology,2014,80(21):6677-6684]。

现有技术研究发现纤维小体元件Doc中存在一段富含亲水性氨基酸的序列D¹D/N³D/N⁵ D/N⁹D¹²，并且通过突变其中的S688–T689和S720–T721之间的序列可以改变来自于不同产生物种的Doc和Coh相互之间的亲和能力，参见文献[Page`s.PROTEINS:Structure,Function, and Genetics,1997,29:517–527；Mechaly.PROTEINS:Structure,Function,and Genetics,2000, 39:170–177]；现有技术中Coh与Doc之间的结合需要大量的钙离子(浓度为0.5mM～2mM)，参见文献[Bule,Journal of Biological Chemistry,2018,293(11)；Xu,Biotechnol Biofuels,2013, 6(1):126]；甚至更高的钙离子浓度(2mM～10mM)，参见文献[Mechaly.PROTEINS:Structure, Function,and Genetics,2000,39:170–177]。

由于代谢的需求，静息状态下微生物细胞内的钙离子浓度一般仅为10^-7M～10^-6M，远低于胞外的浓度(1mM)，参见文献[张倩,中国热带医学,2014,14(11):1309-1313]，因此纤维小体在现有技术下只能在高钙离子浓度下(≥1mM)发挥作用，现有技术无法提供能够在10^-7M ～10^-6M条件下能够有效组装的纤维小体元件，也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度 10^-7M～2mM)中都能发挥作用的纤维小体元件，更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10^-6M)组装的纤维小体元件。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用。