[发明专利]一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用

说明书

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863为一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36863，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述对接蛋白突变体适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑4M的条件与黏连蛋白相互作用；进一步的适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑6M的条件与黏连蛋白相互作用；适用于细胞内环境中与黏连蛋白相互作用；解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下无法自组装的问题。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用。

背景技术

纤维小体是一种通过细胞粘附蛋白附着在厌氧生物表面的一种大的、多酶系的蛋白质，分子量2.0′10⁶～2.5′10⁶D，结合于细菌细胞壁上，生长后期部分脱离细胞并释放到培养液中与底物结合，以胞外多酶复合体的形式存在，功能上类似真菌线粒体，主要由含多种类型粘连模块的非催化亚基脚手架蛋白和含多种类型对接模块的催化亚基酶蛋白两部分组装而成。纤维小体主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白(dockerin，Doc)和含有结构蛋白的粘连蛋白(cohesin，Coh)。纤维小体中已经发现的酶包括内切纤维素酶、外切纤维素酶、纤维二糖水解酶等在内的12种纤维素降解酶，3种以上的木聚糖酶，以及1种地衣多糖酶等，另外，纤维小体还可以通过相互之间锚定作用，形成多聚纤维小体，并包裹一层糖蛋白外衣，形成细胞表面的突起结构。

现有技术研究发现纤维小体元件Doc中存在一段富含亲水性氨基酸的序列D¹ D/N³D/N ⁵D/N⁹ D¹²，并且通过突变其中的S688–T689和S720–T721之间的序列可以改变来自于不同产生物种的Doc和Coh相互之间的亲和能力，参见文献[Page`s.PROTEINS:Structure,Function,and Genetics,1997,29:517–527；Mechaly.PROTEINS:Structure,Function,andGenetics,2000,39:170–177]；现有技术中Coh与Doc之间的结合需要大量的钙离子(浓度为0.5mM～2mM)，参见文献[Bule,Journal of Biological Chemistry,2018,293(11)；Xu,Biotechnol Biofuels,2013,6(1):126]；甚至更高的钙离子浓度(2mM～10mM)，参见文献[Mechaly.PROTEINS:Structure,Function,and Genetics,2000,39:170–177]。

由于代谢的需求，静息状态下微生物细胞内的钙离子浓度一般仅为10^-7M～10^-6M，远低于胞外的浓度(1mM)，参见文献[张倩,中国热带医学,2014,14(11):1309-1313]，因此纤维小体在现有技术下只能在高钙离子浓度下(≥1mM)发挥作用，现有技术无法提供能够在10^-7M～10^-6M条件下能够有效组装的纤维小体元件，也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10^-7M～2mM)中都能发挥作用的纤维小体元件，更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10^-6M)组装的纤维小体元件。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用。

本发明提供一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用，解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下(如细胞内)无法自组装的问题，提供了一种在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10^-7M～2×10^-3M)发挥作用的纤维小体对接蛋白突变体。