[发明专利]一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用

权利要求书

1.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白DocA，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1-2任一项所述突变体36865的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以所述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，设计定点突变引物，以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板，进行PCR，构建重组突变质粒，并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

4.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，由对接蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变为对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

5.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，发酵结束后离心收集菌体，对菌体进行超声破碎，经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

6.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，对接蛋白组合突变体36865的PCR扩增，将质粒分为AB段和BA段，AB段扩增引物为 SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO.12，BA段扩增引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，使用所述扩增引物分别对AB段和BA段进行扩增。

7.如权利要求6所述突变体36865的制备方法，其特征在于，PCR反应体系：

质粒DocA-pET28a载体模板1 μL，正向突变引物F1/F2 2μL，反向突变引物R2/R1 2μL，2× Max Buffer25μL，dNTP 4 μL，DNA Polymerase 1 μL，ddH₂O15 μL。

8.如权利要求7所述突变体36865的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，PCR反应条件：

95℃预变性3min；95℃ 15sec，60℃ 15sec，72℃ 3min，18个循环；补充延伸72℃7min。

9.如权利要求6所述突变体36865的制备方法，其特征在于，PCR反应完成后，需要用DnpI酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化，消化反应体系混匀后，将其于37℃条件下消化2h。

10.如权利要求9所述突变体36865的制备方法，其特征在于，所述消化体系：

PCR扩增产物40μL，DnpI酶1μL。

11.如权利要求6所述突变体36865的制备方法，其特征在于，将消化产物进行DNA凝胶电泳检测，检测后分别将AB段与BA段利用胶回收试剂盒进行回收。

12.如权利要求11所述突变体36865的制备方法，其特征在于，将回收后的AB段与BA段利用Exnase II进行重组，反应产物为待转化载体，重组反应体系如下：

ddH₂O 10 μL，5× CE II Buffer 4 μL，AB段回收产物 2 μL，BA段回收产物 2 μL，Exnase II 2 μL。