[发明专利]一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用

权利要求书

1.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，进行定点突变，获得对接蛋白突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或者一种纤维小体对接蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，进行定点突变，获得对接蛋白突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得对接蛋白突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者一种纤维小体对接蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，进行定点突变，获得对接蛋白突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.权利要求2所述对接蛋白突变体的制备方法，其特征在于，以氨基酸序列SEQ IDNO.3定点突变为氨基酸序列SEQ ID NO.7，或以氨基酸序列SEQ ID NO4定点突变为氨基酸序列SEQ ID NO.8为基础，设计定点突变引物，以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板，进行PCR，构建重组突变质粒，并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵结束后离心收集菌体，对菌体进行超声破碎，经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，以分别连接在pET28a(+)载体NcoI和EcoRI酶切位点间的对接蛋白DocA或DocB为模板，进行对接蛋白突变体的引物设计，进行PCR，构建相应突变体质粒；其中对接蛋白DocA来源于热纤梭菌 (Clostridium thermocellum) xynY基因GenBank: X83269.1，DocB来源于热纤梭菌 (Clostridium thermocellum) celQ基因 GenBank: AB047845.2，DocA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应突变体D-RA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或DocB核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；对应突变体D-RB核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体；

所述制备方法中，对接蛋白DocA氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示突变为突变体D-RA，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或对接蛋白DocB氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示突变为突变体D-RB，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，对接蛋白DocA突变体的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

D-RA-F1如SEQ ID NO.13所示；

D-RA-R1如SEQ ID NO.14所示；

对接蛋白DocB突变体的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

D-RB-F1如SEQ ID NO.15所示；

D-RB-R1如SEQ ID NO.16所示。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，PCR反应体系：

质粒载体模板1 μL，正向突变引物F 2μL，反向突变引物R 2μL，5× FastAlterationBuffer 10μL，FastAlteration DNA Polymerase 1μL，ddH₂O34μL。