[发明专利]一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，具体包括：

步骤一：无菌番茄叶片外植体的获得

11)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的Micro-Tom番茄无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；

12)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5～1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；

13)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；

步骤二：农杆菌侵染叶片外植体

21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h，至菌体完全复苏；

22)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5～6h，至菌液浓度OD600达到0.5～0.6；

23)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；

24)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08～0.12；

25)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；

26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；

27)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；

步骤三：外植体的抗性筛选

31)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；

32)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；

33)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；

步骤四：外植体的继代培养

41)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；

42)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3～5cm；

步骤五：外植体的生根培养

51)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；

52)2～3周，可以见到幼根；

53)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；

步骤六：转基因植株的移土培养

61)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；

62)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；

63)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。

2.如权利要求1所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，步骤一所述无菌幼苗的种植方法为：

1)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；

2)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶30～35粒；

3)放置于暗箱培养3～5d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至2～3cm；

4)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养2～4d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。