[发明专利]一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物医学领域，具体涉及两种小RNA miR‑16和miR‑30c联合用于调控神经干细胞增殖。本申请进行了（1）miR‑16和miR‑30c共同作用下使阿尔兹海默病小鼠海马成年神经干细胞数量增加了1.96倍，n=6，p0.001；（2）miR‑16和miR‑30c过表达后阿尔兹海默病小鼠侧脑室室下区和海马齿状回部位成年神经发生分别增加了13.90，n=6，p0.001和6.71，n=6，p0.001。miR‑16和miR‑30c在调控成年阿尔兹海默病小鼠神经干细胞增殖上作用显著，有助于我们设计出阿尔兹海默病治疗的靶向药物，进而用于临床上阿尔兹海默病的治疗。

技术领域

本发明提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，应用于治疗阿尔兹海默干细胞增殖或神经发生，属于生物医药领域。

背景技术

成年啮齿类和灵长类动物脑内绝大部分神经元没有再生能力，成年神经元发生能力仅局限于位于海马齿状回和侧脑室周围室下区的一部分干性细胞，并且随着年龄的增加，成年神经干细胞的增殖能力不断地降低，特别是近来的研究发现神经性疾病，特别是神经退行性疾病的发生与成年神经的发生能力紧密相关。增强神经发生能力在神经性疾病的诊治上具有重要的应用价值。

miR-16在多种肿瘤细胞中具有抑制增殖的作用，并且其还是早期凋亡的诱发因子，能引起细胞的凋亡。miR-30c对细胞增殖发挥正向作用，能够促进神经系统室下区和海马齿状回处的神经发生能力。

发明内容

本发明提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，通过miR-16和miR-30c作为调控神经干细胞增殖的方法，具体的：

本发明提供一种miR-16与miR-30c联合表达载体，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，所述的miR-30过表达序列miR-30c-OE，其编码序列依次为SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2。

其中，所述的质粒载体为pLV-shRNA2载体；所述的表达载体为双启动子表达载体，具体为双启动子慢病毒载体。

所述的联合表达载体应用于促进神经干细胞增殖。

所述的联合表达载体应用于促进神经发生。

所述的联合表达载体作用的神经细胞为室下区神经细胞和海马神经细胞。

所述的联合表达载体应用于神经干细胞迁移药物的制备。

所述的联合表达载体应用于阿尔兹海默症早期检测试剂的应用。

所述的miR-16下调载体是一种与miR-16成熟序列互补的串联8次的海绵载体序列，其可以捕获细胞中成熟的miR-16序列；所述的miR-30c的过表达载体，是一种可以组成型表达的miR-30c的前体序列。

本发明有益效果

我们首次发现了miR-16和miR-30c随发育的进行而产生差异性表达，两者的表达与年龄呈负相关。构建miR-16下调载体和miR-30c的过表达载体,体外转导神经干细胞，发现miR-16下调和miR-30c过表达，神经干细胞增殖增加；

利用神经干细胞marker和神经前体marker进行标记，发现抑制miR-16的表达和促进miR-30c的表达可使干细胞保持干性，抑制其向神经前体分化。

通过构建能够同时表达miR-16下调序列和miR-30c过表达序列的双启动子慢病毒载体，利用脑立体定位向海马齿状回显微注射该双启动子慢病毒载体，发现室下区和海马齿状回处神经发生分别增加了13.90倍和6.71倍。