[发明专利]一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备

说明书

本发明公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。将本发明得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体可大批量稳定生产，为同步检测噻虫胺和呋虫胺的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的制备和应用。

背景技术

噻虫胺是一种第二代新烟碱类杀虫剂，因具有一个噻唑环基，其性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，作为一种高效广谱的新烟碱类杀虫剂，在过去几年一直是世界性的大型杀虫剂品种，其使用量和销售每年都保持在很高的水平，噻虫胺对非靶标生物毒性以及对生态环境的安全性影响的研究引起了人们的广泛关注。近两年来，全球多个国家推出限制噻虫胺使用的政策，欧盟现已禁止噻虫胺在室外环境下使用。在欧盟标准中，不同的食品中噻虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.01-1.5mg/kg，在中国，噻虫胺的MRLs设定为0.02-2mg/kg。

呋虫胺作为第三代新烟碱类杀虫剂，与其他常见新烟碱类杀虫剂的化学结构区别较大，以四氢呋喃基取代了以前的氯代吡啶基、氯代噻唑基，且不含卤族元素。同时，在性能方面也有所不同，杀虫谱更广、药效持久、对传统新烟碱类药剂已经产生抗性的害虫，防治效果更好。鉴于有些国家和地区对多种新烟碱类农药如吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、噻虫啉等农药品种实施了禁限用政策，呋虫胺日渐成为多种新烟碱类农药杀虫剂的主要代替品，在欧盟标准中，不同的食品中呋虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.02-8mg/kg，在中国，呋虫胺的MRLs设定为0.02-7mg/kg。

为防止消费者和有益生物受到噻虫胺和呋虫胺残留的危害以及潜在影响，对环境和农产品中的噻虫胺和呋虫胺的监测具有重要的意义。目前，针对噻虫胺和呋虫胺的检测方法主要有仪器分析方法和免疫分析的检测方法。仪器分析方法如高效液相色谱、超高效液相色谱-串联质谱等，虽然这些方法灵敏可靠，但需要精密仪器、专业人员、高成本和复杂的制备步骤，因此无法实现大规模的快速现场分析。而基于抗原抗体反应的免疫分析检测方法无需专业的仪器和操作人员即可实现农药残留的快速检测，特别适用于农药残留现场大规模快速筛选和检测，可作为仪器分析方法的辅助或代替的方法，在农药残留分析中应用前景广阔。

抗体是免疫分析方法中的关键反应元件，其质量的好坏直接影响了免疫分析方法的建立。从现有报道来看，国内外农药抗体的研究仍主要集中在传统抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及重组片段抗体，其在免疫分析上的应用上具有一定的局限性。如多克隆抗体存在免疫动物处死放血后，需要重新免疫，且抗体的均一性较差等问题；单克隆抗体的制备需要长期依赖杂交瘤细胞，若杂交瘤细胞发生抗体基因突变或细胞株丢失，则需重新研制、周期较长。随着基因工程技术的发展，第三代重组抗体的产生使得抗体的制备摆脱了对动物的依赖，确保不同批次制备的同一抗体具有高度的稳定性和一致性。另一方面，在获得抗体可变区基因序列的基础上，可实现抗体“永生”的目的。尽管针对农药的重组抗体研究早已报道，但多数是基于重组片段抗体单链抗体、抗原结合片段Fab等研究，其在生物活性等方面不能完全媲美于传统抗体，如重组片段抗体因其分子结构不同于天然抗体的“Y”型结构会出现不利于与胶体金、量子点等标记物偶联形成具有稳定识别活性的免疫探针等现象。因此，亟需开发具有可重现生产、稳定推广的新型重组抗体，这对于农药残留免疫速测技术及其的产品的开发与应用具有重要意义。