[发明专利]一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法

权利要求书

1.一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；

(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；

(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。

2.根据权利要求1中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：所述纤连蛋白固定于钛粉表面的方法如下：

(a)纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；

(b)另配制0.5M的NaOH溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；

(c)配制2％氨丙基三乙氧基硅烷APTE溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入APTE溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强APTE与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉A；

(d)用EDC/NHS/PBS体系配制浓度为150μg/mL的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液pH7.0；

(e)将硅烷化钛粉A重悬浸泡在纤连蛋白溶液中反应15min，0.01M的PBS洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。

3.根据权利要求1中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂为40～100mM的PMSF和1mM的Pepstatin A。

4.根据权利要求1中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度50～200mM的精氨酸、蛋白保护剂总重0.2～2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/ml EDTA，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为Tris-NaCl缓冲液，所述Tris-NaCl缓冲液为终浓度50mM的Tris，终浓度100mM的NaCl，pH8.0。

5.根据权利要求2中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：

将硅烷化钛粉B浸泡在5～10μg/mL亮抑蛋白肽酶溶液中吸附固定15min，随后0.01M的PBS洗掉未结合的亮抑蛋白肽酶，将固定吸附有亮抑蛋白肽酶的钛粉加入储存液中，再与固定有纤连蛋白的固体粉末充分混合。

6.根据权利要求5中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法的制备方法，其特征在于，所述硅烷化钛粉B的粒径为硅烷化钛粉A粒径的100倍，使用时，筛除硅烷化钛粉B颗粒。