[发明专利]一种甘薯黑斑病菌的实时荧光RPA检测引物及其应用

权利要求书

1.一种用于检测甘薯黑斑病菌的RPA引物和探针组合，其特征在于，所述的RPA引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成。

2.权利要求1所述的RPA引物和探针组合在检测甘薯黑斑病菌上的应用。

3.一种甘薯黑斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括再水化缓冲液、280mM醋酸镁、RPA冻干酶粉和ddH2O；所述的RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉，再水化缓冲液 29.5 μL，10 μM上游引物 2.1 μL，10 μM下游引物 2.1 μL，10 μM探针0.6 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 11.2 μL，280mM醋酸镁 2.5 μL。

6.权利要求3-5任一所述的检测试剂盒在鉴定甘薯黑斑病菌上的应用。

7.利用权利要求1所述的RPA引物或探针组合对甘薯黑斑病菌进行实时荧光RPA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测真菌DNA：利用Fungal gDNA Kit 试剂盒提取，并按照说明书进行操作；

（2）配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5 μL，10 μM上游引物 2.1 μL，10 μM下游引物2.1 μL，10 μM探针 0.6 μL，待测样品DNA 2 μL，ddH2O 11.2 μL，280mM醋酸镁2.5 μL；充分混合均匀；

（3）RPA扩增及结果的判读：将步骤（2）的反应管置于恒温荧光核酸扩增仪中，在39℃反应20 min，且每20 s收集一次荧光信号，采集荧光数据，并在反应第4 min时取出反应管并混匀反应液，然后再放回恒温荧光核酸扩增仪继续反应；绘制时间-荧光信号图，构建扩增曲线；如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。