[发明专利]一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法

权利要求书

1.一种检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过PCR扩增EG95基因片段，得到如SEQ ID NO：1所示的核酸序列；

2)将核酸序列采用EcoR I和Xho I同时酶切，连接到pET32a质粒载体上，构建表达质粒；

3)将表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株，将表达菌株培养并进行IPTG诱导表达，得发酵菌液；

4)将发酵菌液经超声破碎后得包涵体；

5)将包涵体洗涤，裂解，离心，取上清液，经Ni²⁺-NTA亲和层析系统纯化；

6)将纯化后的产物进行透析，浓缩，冻干，磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释，即可。

2.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，构建表达菌株具体为：将甘油菌种，按体积百分含量为2％比例接入含Amp的LB液体培养基中，于37℃条件下，振荡培养，得初级发酵菌液；将初级发酵菌液按2％比例转接入含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达，即可。

3.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，包涵体洗涤所用洗涤液的制备：取NaCl和1M pH8.0 Tris-HCL(三(羟甲基)氨基甲烷)，加水定容，即可；

所用裂解液的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0 Tris-HCL，加水定容，即可。

4.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液B的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0Tris-HCL，加水定容，即可。

5.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液C的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0Tris-HCL，加水定容，即可。

6.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，具体为：用洗涤液洗涤包涵体，然后加入包涵体裂解液中，搅拌过夜，离心，取上清液即为融合蛋白的包涵体变性液；将包涵体变性液先过DS0130亲和层析柱初滤，再用0.22μm滤器过滤，即得蛋白粗滤液；采用Ni2+-NTA亲和层析系统对蛋白粗滤液进行纯化，即可。

7.根据权利要求1所述检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中，透析采用10KD透析袋，在4℃下透析16h，透析液为1mM PBS。

8.如权利要求1至权利要求7任一所述制备方法制得的检测羊棘球蚴抗体用的抗原。

9.检测如权利要求8所述抗原用的琼脂扩散板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

向琼脂糖中加入去离子水和0.1mM PBS，加热至琼脂糖完全融化，然后加入聚乙二醇6000、MES和氯化钠，搅拌至完全溶化，冷却至45～60℃倒入平皿中，打孔，挑出孔内琼脂，将板底部烘烤封底，即可。

10.根据权利要求9所述琼脂扩散板的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖、水、0.1mMPBS、聚乙二醇6000、MES和氯化钠按g:mL:mL:g:g:g计为0.8:90:10:1:1:0.8。