[发明专利]一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗、底物显色液、终止液和血清稀释板；

所述EG95多肽抗原包被酶标板采用如下方法制备：利用多肽合成仪合成SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，纯化后得EG95多肽抗原；用包被缓冲液将纯化后的EG95多肽抗原配制成浓度为4μg/mL，按100μL/孔，加入酶标板中，在4℃条件下，包被过夜14～18h，弃去包被缓冲液，洗涤，拍干，每孔加入200μL封闭液，在37℃条件下，封闭2h，弃去封闭液，洗涤，真空包装后置于4℃保存；

所述稀释液包括体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，浓度为200μL/L的防腐剂Proclin 300，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液包括体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；

所述封闭液为含2％明胶的磷酸盐缓冲液；

所述阳性对照液采用如下方法制备：以羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫制备的高免血清，作为储备阳性对照血清，将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被酶标板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，作为阳性对照血清，于-20℃保存备用；

所述阴性对照液采用如下方法制备：用健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清，作为储备阴性对照血清，将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被酶标板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，作为阴性对照血清，于-20℃保存备用；

所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG酶标二抗体；使用二抗保护剂以1:200稀释后制得；

所述底物显色液包括溶液A和溶液B；所述溶液A包括体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述溶液B包括0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺的混合溶液；

二抗保护剂的制备：取海藻糖、PEG4000、PVP K-30、PVA9000-10000、D-ribose、1-甲基-2-吡咯烷酮、异噻唑啉酮，加蒸馏水定容，过滤除菌，即可。