[发明专利]一种环状促红素衍生肽在肾损伤和环孢素A损伤保护中的应用

权利要求书

1.一种环状促红素衍生肽在肾损伤和环孢素A损伤保护中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种环状促红素衍生肽在肾损伤和环孢素A损伤保护中的应用，其特征在于步骤为：

第一步：建立小鼠肾损伤模型：将25-30g的雄性BALB/c小鼠随机分为5组，每组6只，即n=6，其中对照组：暴露腹腔和肾蒂，以0.01 ml/g的1％戊巴比妥进行麻醉； IR组：分离两个肾蒂，用血管钳将其夹闭30分钟使肾脏变色，随后放开血管钳，使血液再灌注2或8周；IR +CsA组：将2 mg CsA溶于1 ml橄榄油中，按35mg/kg体重的标准每天给IR组小鼠灌胃；IR +CHBP组：将 0.11 mg CHBP溶于32ml 0.9％的生理盐水中，按24 nmol/kg体重的标准对IR组小鼠腹腔注射，每3天一次；IR + CsA + CHBP组：用CsA每天灌胃和CHBP每3天一次同时治疗IR组小鼠；

第二步：使用代谢笼在第2、4、6和8周收集尿液样本，在2或8周时，处死动物，收集血液样本和肾脏样本，肾脏样本用10％（w/v）中性福尔马林缓冲液固定，在液氮中速冻后保存在-80℃备用，尿液样本使用自动生化分析仪测量尿白蛋白/肌酐，血液样本使用自动生化分析仪测量血清肌酐（SCr）；

第三步：肾脏样本石蜡包埋切片，切片用苏木精和伊红（HE）染色，肾小管间质损害（TID）程度的半定量评估分为0-4分：损伤区域的百分比小于5％得0分；5％-25％得1分；25％-50％得2分；50％-75％得3分；超过75％得4分；评估参数包括肾小管腔内的肾小管扩张和空泡，间质扩张，炎性细胞浸润，蛋白管型，管腔内细胞或细胞碎片；每张切片在200x放大倍率下随机选择12个皮层视野进行评分；

第四步：Masson三色染色，检测了肾小管间质纤维化，每张切片在400x放大倍率下随机选择20个皮层视野，使用Image-Pro Plus软件扫描评估胶原沉积；

第五步，切片使用ApopTag过氧化物酶试剂盒用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）原位标记片段化DNA （ISEL）：将切片在37℃下用40 µg/mL蛋白酶K消化15分钟，然后在37℃下与TdT和异羟基洋地黄毒苷-dUTP一起孵育60分钟，加入异羟基洋地黄毒苷-过氧化物酶复合物30分钟后，将切片用3'-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物显影，在200x视野中选择20个视野检测小管、管腔和间质区的凋亡细胞；

第六步，蛋白质印迹分析：制备25微克的肾脏蛋白在12-15%的聚丙烯酰胺变性凝胶上分离，并将其转印到PVDF膜上，在用caspase-3抗体，HMGB1抗体，内参β- actin孵育之前，用5%牛奶封闭，用过氧化物酶偶联的二抗孵育后，使用分子成像器Chemi Doc XRS +系统扫描显影，并通过Image Lab软件进行半定量分析；

第七步，实时定量PCR：通过逆转录（RT）实时定量多聚酶链反应（qPCR）在StepOne Plus实时PCR系统中检测肾脏和TCMK-1细胞中的Caspase-3 mRNA，Caspase-3和管家基因GAPDH的探针被6-羧基荧光素（FAM）标记，用Trizol试剂提取的2μg总RNA用于逆转录成cDNA，用Taq聚合酶在qPCR反应缓冲液中扩增2μl cDNA，其中含有900 nM正向、反向引物和250 nM探针的反应体系在95℃下10分钟，随后在95℃下15秒和60℃ 1分钟进行40个循环，将正常组作为对照，GAPDH作为矫正，使用2^-ΔΔCt方法计算caspase-3 mRNA的表达；

第八步，蛋白芯片分析：蛋白芯片试剂盒中蛋白芯片利用50 µg蛋白同时检测18种磷酸化或裂解的信号分子，根据芯片使用说明，通过将载玻片短暂暴露于分子成像系统来获取图像，并使用Alpha View软件3.3，通过扫描体积密度进行半定量分析；

第九步，TCMK-1细胞培养：在含有10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素G和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养TCMK-1细胞，在有/无CHBP的条件下，细胞长融合至60-70％时用CsA持续处理24小时，使用Lipofectamine @ RNAiMAX将Caspase-3 siRNA转染到TCMK-1细胞中，双链CASP-3siRNA的序列为： 5'-GCUUCUUCAGAGGCGACUAtt-3'和5'-UAGUCGCCUCUGAAGAAGCta -3'，其中阴性对照siRNA未靶向任何已知的哺乳动物基因，将siRNA转染的细胞培养4-6小时，在有/无CHBP处理的细胞中加入CsA；

第十步，流式细胞仪测定细胞凋亡：收集帖壁的TCMK-1细胞，将细胞沉淀重悬于缓冲液中，并与annexin-V和PI避光孵育15分钟，将仅孵育annexin-V或PI以及无染料组为对照，通过BD FACS Calibur流式细胞仪，使用Cell Quest研究软件，对样品进行分析，计数10000个细胞，结果象限点图显示：存活细胞（Annexin V-/PI-），早期凋亡细胞（Annexin V +/PI-），晚期凋亡细胞（Annexin V +/PI +）或坏死细胞（Annexin V-/PI +），每种类型的细胞数均表示为总门控细胞的百分比；

第十一步，统计分析：使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，数据表示为平均值±平均值的标准误（SEM），使用方差分析（ANOVA）来比较三组或更多组之间的结果，使用双侧t检验来比较两组之间的结果，P≤0.05被认为具有统计学意义，来自细胞培养研究的所有数据代表至少三个独立的实验。