[发明专利]β-酮己二酸代谢相关三个基因的结构优化与应用

说明书

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的β‑酮己二酸代谢相关的三个基因及其应用。每个基因都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 4、SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，工程菌能够将β‑酮己二酸完全降解且以β‑酮己二酸为碳源生长，优化后基因可用于构建有机污染修复工程生物。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的β-酮己二酸利用相关三个基因的序列。

技术背景

芳香族化合物是一类重要的有机污染物，它能通过各种工业、农业、制药和市政排放等人类活动进入环境造成污染。而传统的污染修复方式主要是物理和化学方法，存在成本高、设施复杂、修复效率低等问题。通过生物处理，修复环境中的芳香族污染物是一个可行的替代方案。对降解机理的深入研究，有助于我们充分利用丰富的自然资源。

目前已发现许多好氧细菌和真菌能够以某种芳香族化合物为唯一碳源和能源，这证明在这些微生物中存在这些芳香族化合物的代谢途径。目前，普遍认为微生物可以在有氧或者厌氧条件下对芳香族化合物降解先是通过外围代谢途径（Peripheral catabolicpathway）将不同的酚类化合物转化为少数几种核心代谢产物（Predominant products）包括：邻苯二酚、对苯二酚及它们的衍生物等，而这些核心代谢产物再通过一些相同或相似的核心代谢途径（Central catabolic pathway）转化为三羧酸循环的中间代谢物（Citratecycle itermediates），最终为微生物所利用。

β-酮己二酸途径就是一个广泛存在于土壤细菌和真菌中核心代谢途径。核心代谢产物原儿茶酸或邻苯二酚通过不同的分支形成β-酮己二酸内酯，之后通过共同途径生成β-酮己二酸。而β-酮己二酸再通过β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶和β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶的催化生成琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，从而进入三羧酸循环，为微生物所利用。这一代谢途径是许多芳香族化合物降解的最终通路，也是将降解产物与三羧酸循环链接的桥梁，主要包括苯、酚、甲苯、苯甲酸、烷基苯、硝基酚、氯酚、萘等都能通过β-酮己二酸途径降解。

虽然目前已知大量微生物具有有机污染物降解能力，但具体到能降解某一特定种类物质时，可供选择的微生物数量和种类比较有限，难以满足生物修复技术的需求。通过生物技术手段，选择合适的宿主，构建污染修复工程生物是一种可行的解决方案。而β-酮己二酸到琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A转化，是β-酮己二酸途径是不同代谢分支汇合后的最终代谢过程，是将有机污染物中的碳原子引入微生物自身代谢网络并供其利用的桥梁，是构建多种不同有机污染修复工程生物的基础，因此成功实现这一代谢途径的异源表达具有重要的意义及应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供能够在大肠杆菌中表达的β-酮己二酸代谢相关三个基因的优化重组与应用：

pcaI基因：编码β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶α亚基

pcaJ基因：编码β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶β亚基

pcaF基因：编码β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶

β-酮己二酸经过两步酶促反应生成珀酰辅酶A和乙酰辅酶A。