[发明专利]碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法

说明书

本发明公开了一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法，本发明引入了对ALP敏感且具有良好生物相容性和自组装特性的小分子多肽作为凝胶因子前驱体，其在ALP的催化作用下能够脱除分子上的磷酸基团生成NY，触发超分子自组装，从而协同诱导SF共自组装，最终导致SF水凝胶的快速形成。SF‑NY水凝胶网络中包裹的ALP仍然保持着其催化活性，并通过催化β‑甘油磷酸酯释放出游离的磷酸根离子，从而在凝胶中诱导磷灰石矿物质的形成。由于温和的凝胶化过程以及在凝胶基质中形成了磷灰石矿物质，仿生矿化后的SF凝胶不仅可以用作仿生支架，在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的粘附，增殖和成骨分化，而且还可以在大鼠模型中促进股骨缺损的自然愈合。

技术领域

本发明涉及一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法，属于材料技术领域。

背景技术

在自然界中，生物矿化过程受到许多有机组分的影响，包括蛋白质、多糖和酶，这些有机成分对调控羟基磷灰石晶体的生长具有重要的作用。在天然骨形成的过程中，由成骨细胞分泌的碱性磷酸酶(ALP)通过从有机磷酸盐中释放出无机磷酸根离子，从而增加了局部磷酸盐的浓度，促使羟基磷灰石(HA)矿化。在水环境中，碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)能够催化脱除底物分子上的磷酸基团，使底物疏水性增强。2004年，Xu等第一次报道了在碱性磷酸酶的催化下，底物分子Fmoc-pY(Fmoc＝芴甲氧碳基，pY＝磷酸化酪氨酸)脱除磷酸基团生成Fmoc-Y，在π-π相互作用下形成水凝胶，同时自组装形成纳米纤维网络结构，水凝胶的储能模量在1000Pa左右。而后，从这一开创性的工作开始，大量的基于磷酸酶催化构建的肽水凝胶被陆续报道，包括Fmoc-FpY，Ac-YYYpY-OMe(Ac＝酰基)，Nap-GFFpY-OMe(Nap＝萘基)，Nap-FFGEpY，NapFFpY等。

蚕丝蛋白(Silk Fibroin)又名：丝素蛋白，是一种天然的高分子纤维蛋白，其中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)约占总组成的80％以上。由于其具有优异的生物相容性、可控的生物降解性以及良好的柔韧性和抗拉伸强度等优点，得到了科学家们的广泛研究。大量的以蚕丝蛋白为基材构建的生物材料(如纳米纤维、海绵、薄膜、微球、水凝胶等)被陆续报道，广泛应用于骨组织、皮肤、血管、神经、肌腱和韧带等在内的各种机体组织的修复。其中蚕丝蛋白水凝胶因其具有与天然细胞外基质相似的纤维结构，高含水量，可调的多孔性以及与细胞亲和力好等优点，备受研究者们的青睐。但是，在生理条件下，蚕丝蛋白溶液的凝胶化过程十分缓慢，例如，在室温条件下，浓度为2.0％的蚕丝蛋白水溶液在生理条件下由溶液到凝胶的转变需要超过14天。因此，通常需要在酸性条件下(pH＝4左右)或较高温度(60℃)时才会发生凝胶化。种种这些因素极大地限制了蚕丝蛋白水凝胶在生物医学领域的广泛应用。为了改变蚕丝蛋白凝胶化pH低、温度较高以及所需时间长的特点，科学家们做了很多研究工作。例如，通过超声处理、旋流剪切以及通电等物理方法来诱导蚕丝蛋白的二级结构从溶液时的无规卷曲构象向凝胶状态时的β-折叠构象转变，从而加速蚕丝蛋白的凝胶化进程。科学家们还通过向蚕丝蛋白溶液中加入有机试剂、无机物复合物、离子液体、高压二氧化碳、表面活性剂以及人工合成高分子等化学试剂来调节其与蚕丝蛋白链之间的相互作用，从而改变蚕丝蛋白的凝胶特性，促使蚕丝蛋白凝胶快速成型。此外，科学家们还利用聚(乙二醇二缩水甘油醚)(PGDE)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、京尼平、氯金酸等作为化学交联剂，制备出具有良好的机械强度和稳定性的蚕丝蛋白凝胶材料。