[发明专利]一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法

说明书

本发明涉及一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。所述冻存高效稳定剂主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液。所述冻存剂中，所述脯氨酸浓度为1‑2％(W/V)、所述蔗糖的浓度为5‑6％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3‑6％(W/V)、所述乙二醇的比例为5‑8％(V/V)、所述依克多因的浓度为2‑5％(W/V)，所述聚乙烯醇的浓度为1‑3％(W/V)，所述不含酚红的基础细胞培养液比例为92‑95％(V/V)。本发明冻存高效稳定剂不含二甲基亚砜(DMSO)，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，也避免了复苏后细胞回输给患者时出现不良反应和毒副作用，确保临床应用安全，可直接用于临床细胞免疫治疗，安全有效。

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，涉及一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。

技术背景

细胞免疫治疗技术是近年来临床肿瘤治疗新兴技术，也被视为最有前景的技术之一，人类外周血免疫细胞包括淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞等在基础医学研究和临床治疗应用日益受到广泛的重视。尤其外周血单个核细胞(PBMC)也是体外制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等的种子细胞。这些细胞保存特别是冷冻保存无论是基础研究还是临床应用都十分重要，尤其是体外诱导的杀伤细胞(CIK)细胞、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等是过继性细胞免疫治疗技术研究的重点和热点。在临床研究及治疗应用过程中，有的患者很难保证具有足够数量的免疫细胞和细胞因子诱导的免疫细胞，在一定的情况下需要将免疫细胞尤其是外周血单个核细胞(PBMC)进行冷冻保存，一段时间以后再诱导扩大培养，根据临床治疗的需要将已诱导培养的细胞分别在不同时间段进行回输治疗，每次输注相隔一定的时间，也需要将已培养后的细胞冷冻保存。细胞冻存和复苏效果容易受到技术员人员操作、环境以及冻存液性能的影响，使冻存细胞数量及活性具有显著差异。

目前国内大多数实验室细胞冻存多采用传统方法将胎牛血清和RPMI1640培养液以及二甲基亚砜(DMSO)按照一定的比例混合进行细胞冻存，其优点是能够长期保存细胞，操作简单方便，成本低廉，细胞复苏后的存活率通常在70％─90％之间。缺点是由于二甲基亚砜(DMSO)具有一定的毒副作用，细胞复苏后必须进行细胞洗涤，否则不利于细胞培养生长。传统的细胞冻存方法加入胎牛血清，引入了外源性成分，大大增加病原污染的风险。据报道，添加DMSO及动物血清保存细胞，在细胞回输人体后有可能会引起过敏反应，会对人体过继细胞免疫治疗产生一定的影响。也有部分学者在传统技术上进行改良采取β─葡聚糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白或自体血浆和普通细胞培养液混合用于冻存自体外周血免疫细胞，这种方法减少了外源性的风险，但其细胞冻存时间周期不一，冻存后细胞存活率还存不稳定性，无法满足临床治疗的需要。国外已经研发并推出商品化的无血清细胞冻存液，如CELLBANK、BAMBANKER、LABOBANK等品牌，这类产品几乎都不含胎牛血清，没有动物来源成分，细胞冻存复苏后存活率高达80-90％，但是有些商品化冻存液中仍然含有DMSO成分，通常商品化细胞冻存液市售价格较为昂贵。

因此，既能满足人类外周血单个核细胞(PBMC)以及体外细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞的冻存的需要，又成本低廉，使用方便，安全高效优势，且冻存液中不含有动物血清及DMSO成分，确保临床应用安全的细胞冻存液具有较大的临床需求，和有构建必要性。

发明内容

本发明的目的在于构建一种安全有效的人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种人类外周血免疫冻存高效稳定剂，主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液。