[发明专利]两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组

说明书

本发明提供一种敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA。针对水稻OsPLS4基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，实现对水稻OsPLS4基因的敲除。其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR‑CAS9技术对水稻内源基因OsPLS4进行编辑，获得了OsPLS4敲除突变体。利用本发明制备的sgRNA能高效、快速、精确靶向水稻OsPLS4基因，在基础研究(水稻早衰分子机理)和生产实践(水稻早衰品种改良和抗逆育种)上具有一定的意义。

技术领域

本发明明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及两个基于 CRISPR-CAS9技术定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组及应用。

背景技术

OsPLS4基因编码3-酰基还原酶，该酶的功能在细菌和动物里面研究较多，主要参与脂肪酸从头合成的第二个阶段，属于KR蛋白酶，是脂肪酸合酶复合体(Fatty AcidSynthase,FAS)的重要组成成分，而FAS酶是脂肪酸合成的重要复合物之一。脂肪酸合成过程分别为饱和脂肪酸的从头合成、脂肪酸碳链的延长和不饱和脂肪酸的生成等。

在植物中，表皮蜡质是植物抵御外来生物和非生物胁迫的第一道屏障，其主要有超长链脂肪酸及其衍生物组成，因此脂肪酸合成对植物表面的蜡质层的形成至关重要。近年来，对植物的表面蜡质研究越来越多，很多研究结果表明水稻表面蜡质积累量减弱导致其抗旱保水能力减弱。同时，不饱和脂肪酸对植物的耐寒性非常重要。因此对水稻脂肪酸合成相关基因进行研究，可以进一步探索脂肪酸调控植物表面蜡质合成作用机理，揭示脂肪酸在植物抗逆方面作用，为粮食安全生产提供理论依据。

最近，CRISPR-CAS9基因编辑技术在作物上研究取得巨大成功。因此利用此技术，敲除脂肪酸合成相关基因OsPLS4来获得其突变体对分析该基因功能以及阐明脂肪酸在水稻生长发育以及抗逆过程中的调控机制具有重要作用。本发明通过设计sgRNA构建基因编辑载体、转基因技术和CRISPR-CAS9技术获得转基因植株、测序分析获得OsPLS4基因编辑(敲除)的植株及序列编辑情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲除水稻3-酰基还原酶基因OsPLS4的方法，提供了一种基于CRISPR-CAS9技术敲除水稻OsPLS4的sgRNA以及用于敲除水稻OsPLS4基因的载体。使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsPLS4的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)选择OsPLS4基因编码区第672-690和第766-784核酸序列两个靶位点作为CRISPR/Cas9系统的靶序列(SEQ ID NO.1):TTACAGTGCTGCCAAGGCT

(SEQ ID NO.2):TGTCAGATGCAATGAAACC

根据靶序列设计四条oligo DNA：

(SEQ ID NO.3)PLS4(1)F：GGCATTACAGTGCTGCCAAGGCT

(SEQ ID NO.4)PLS4(1)R：AAACAGCCTTGGCAGCACTGTAA

(SEQ ID NO.5)PLS4(2)F：GGCATGTCAGATGCAATGAAACC

(SEQ ID NO.6)PLS4(2)R：AAACGGTTTCATTGCATCTGACA

b)将oligo DNA组PLS4(1)F和PLS4(1)R、PLS4(2)F和PLS4(2)R混合，通过退火反应形成二聚体结构，然后与线性化的pYL-Hs载体片段进行连接，构建含有水稻OsPLS4基因两个靶序列的pYL-Hs-PLS4-cas9质粒。