[发明专利]含有MC1R基因的重组腺相关病毒的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及MC1R基因的重组腺相关病毒的应用，更具体的，涉及含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明构建的腺相关病毒是目前所有的唯一一个可以特异性在兴奋性神经元中表达MC1R的病毒。注射该病毒的小鼠能够增强长期记忆，该结果表明，本发明的重组腺相关病毒有望用于开发与长期记忆损伤相关的疾病的药物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及含有MC1R基因的重组腺相关病毒的应用。

背景技术

黑素皮质素1受体(MC1R)是一种环腺苷单磷酸刺激g蛋白偶联受体(GPCR)，通过黑色素合成途径调节皮肤生理。人类MC1R的功能缺失变异与红发、白皮肤和增加患黑素瘤的风险有关。在小鼠中，MC1R失活突变具有类似于人类红发/白皮肤的表型，导致皮肤保护受损，增强黑色素瘤的形成。此外，MC1R失活突变小鼠的皮肤出现了更严重的氧化损伤，表明MC1R和氧化应激介导的致癌机制有相关性。除了皮肤黑色素细胞，其他表达MC1R的组织和细胞类型包括肾上腺组织、免疫细胞、内皮细胞、1还有人星形细胞和神经元，这表明MC1R的功能可能不仅限于调节皮肤状态、毛发颜色、黑色素瘤，还有可能在神经系统中发挥重要的作用，目前的研究发现MC1R基因的改变还和帕金森病相关，这提示MC1R在神经系统疾病中可能有潜在治疗效果，但是MC1R在神经系统中的功能还不清楚。

为了进一步研究MC1R在神经系统中的功能，本发明构建了能够在兴奋性神经元中特异性表达MC1R的腺相关病毒，该病毒可以增加MC1R基因在兴奋性神经元中的表达量，便于进一步研究MC1R在神经系统中的功能以及治疗神经系统中缺乏MC1R造成的病理损伤。

发明内容

有鉴于上述技术问题，本发明的目的之一是提供含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述重组腺相关病毒的构建及包装，包括如下步骤：

S1、提取小鼠总RNA，反转录成cDNA；

S2、设计扩增引物，以S1的cDNA进行PCR扩增，获得目的基因MC1R；

S3、将目的基因插入AAV载体pAAV-CaMKIIα-eGFP的EcoR I和Hind III酶切位点之间，得连接产物；

S4、将所述连接产物转化至H5α感受态，培养，经阳性克隆鉴定，测序正确的为插入目的基因的rAAV重组腺相关病毒载体pAAV-CaMKIIα

-eGFP-MC1R；

S5、将质粒pAAV-DJ/8，pHelper及pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R共转染至HEK293T细胞，转染后更换为完全培养基，然后收集富含AAV病毒颗粒的HEK-293细胞，纯化病毒，纯化产物即为能够特异性在兴奋性神经元中特异性表达MC1R基因的重组腺相关病毒。

进一步的，扩增引物具体为：上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ IDNO.3所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明构建的腺相关病毒是目前所有的唯一一个可以特异性在兴奋性神经元中表达MC1R的病毒。

2、本发明构建的腺相关病毒可以在小鼠脑部的特定神经元(兴奋性神经元)中表达黑素皮质素1受体基因MC1R，小鼠海马区的兴奋性神经元中高表达MC1R基因后对小鼠的长期记忆会造成影响，具体为该病毒在小鼠海马齿状回中表达可以提升长期记忆，有望用于开发与长期记忆损伤相关的疾病的药物，如阿尔兹海默症。

附图说明