[发明专利]一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针

说明书

本发明涉及一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，所述引物序列为：上游引物DuCV‑F：5’‑GAGTTCTGCACGCTCGACAA‑3’，下游引物DuCV‑R：5’‑CTCTTCCTCCCAGCGACTCT‑3’；所述探针序列为：探针DuCV‑probe：5’‑AAGYAAYGCGMGAGCTGCCGCCCTT‑3’；利用所述引物和探针进行鸭圆环病毒检测，灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸭圆环病毒特异性检测，为后续科学研究鸭圆环病毒致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针。

背景技术

实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指Real-time PCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、Cy5、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团(Reporter，R)标记，可同时对单一样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。