[发明专利]一种精氨酸脱亚胺酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种精氨酸脱亚胺酶突变体及其编码基因和应用，属于分子生物学技术领域。所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用易错PCR技术对野生型的短乳杆菌精氨酸脱亚胺酶进行改造，筛选获得高酶活突变体H265R，该突变体的催化活性显著提高，可用于体外瓜氨酸的生物制备；本发明提供的突变体具有显著的抗肿瘤细胞生长活性，而且在生理pH条件下具有很好的稳定性，具有潜在的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种精氨酸脱亚胺酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,EC 3.5.3.6，ADI)是一种存在于支原体、单细胞绿藻、细菌等微生物的精氨酸降解酶，在生物体内将精氨酸催化生成瓜氨酸和氨。早前，ADI主要应用于转化精氨酸生产瓜氨酸。近年来的研究证实精氨酸脱亚胺酶具有显著的抗肿瘤活性，对精氨酸-琥珀酸合成酶表达缺陷的肝癌、黑色素瘤、前列腺癌等癌细胞的生长都具有强烈的抑制作用，在抗肿瘤药物开发领域具有较好的潜力。

目前，多种微生物来源的ADI均被发现有一定的抗癌活性，但不同来源的ADI，其氨基酸组成、酶学性质及抗肿瘤的种类却有着较大的区别，来自Mycoplasma arginni和Pseudomonas plecoglossicida的ADI氨基酸同源性只有27.1％。

目前研究较多的精氨酸脱亚胺酶来自于支原体，支原体来源的ADI在体内可显著抑制HCC、黑素瘤、白血病、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞等多种癌细胞的生长。支原体来源的ADI抑制肿瘤的有效性和广泛性与其在中性生理条件下与精氨酸亲和力较高(米氏常数可达0.2mmol/L)密切相关。但支原体是一种寄生的、致病的微生物，作为一种在人体上使用药物的来源，存在安全性的隐患。因此，挖掘益生菌源的精氨酸脱亚胺酶逐渐成为热点的领域之一。

现有报道中，李成付等获得了一株ADI高产菌株(粪肠球菌NJ402)并发现适当浓度的Mn²⁺、Mg²⁺及Co²⁺对该ADI催化活力有较大促进作用(粪肠球菌精氨酸脱亚胺酶酶学性质研究.微生物学通报，2008，35(6)：846-850.)。

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在动物及植物发酵产品以及温血类动物的消化系统中十分常见，是一般认为安全的食品级微生物。来自乳酸菌ATCC7962的ADI被发现可抑制SNU-l胃癌细胞的繁殖，其Km为8.7mmol/L，远大于支原体来源ADI的0.2mmol/L。

发明内容

本发明的目的在于对短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的精氨酸脱亚胺酶进行改造，获得酶催化性能提高的突变体，开发食品级的精氨酸脱亚胺酶，提升精氨酸脱亚胺酶在工业上的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明以短乳杆菌(Lactobacillus brevis)野生型精氨酸脱亚胺酶编码基因为模板，进行易错PCR扩增，构建突变文库，以扩增片段构建重组载体，获得突变基因文库；将突变基因文库转化感受态细胞，构建突变文库，利用乳糖或IPTG等诱导剂诱导文库表达，获得表达文库；对表达文库进行酶活性分析和序列测定，筛选得到一种催化性能提高的短乳杆菌精氨酸脱亚胺酶突变体，即氨基酸序列的第265位组氨酸(H)突变为精氨酸(R)。

本发明提供了一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。