[发明专利]一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用

说明书

本发明提出了一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用，涉及生物工程技术领域。本发明提供的重组thaumatin II结构基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。此外，本发明还提供了一种利用该基因生产甜蛋白的方法，将合成的重组thaumatin II结构基因克隆到乳腺特异性表达载体pBC1上，得到表达载体pBC1‑thaumatin II，将上述表达载体酶切后得到的载体真核部分转入受精卵，再转入受体动物，分娩后得到模型动物，收集模型动物的乳汁，得到thaumatin II甜蛋白。本发明提供的生产方法可制备活性和甜度类似于天然产物的重组thaumatin II，且无需再对动物乳汁进行纯化，可直接使用。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用。

背景技术

长期以来，葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉等是食物和其他消费类产品中最常用的甜味剂。这些传统的甜味剂营养性和安全性高，但是甜度较低、使用量较大、热量极高，长期食用非常容易引起心脑血管疾病、高血压、肥胖、糖尿病以及龋齿等等，在很多国家已经成为一大社会问题，严重威胁人类生命健康。阿巴斯甜、安赛蜜、纽甜、糖精和三氯蔗糖等无热量的人工甜味剂被科学家开发出以解决上述问题，尽管已经在全球范围内大量应用，但是依然存在引起头晕、头痛、肠胃问题以及肥胖等不良问题，它们的代谢产物也可以造成环境污染。这些问题促使科研人员开始寻找新的天然物质，以满足人们的生活需要。自1972年起，thaumatin、monellin、mabinlin、miraculin、pentadin、curculin和brazzein等多种热带植物甜蛋白相继被发现。这些甜蛋白具有甜度高、热量低、不致龋和安全性高等多种特点，应用前景非常广阔。甜蛋白不会对人类的健康造成影响，而thaumatin是目前研究最为广泛的甜蛋白，是蔗糖和人造甜味剂最有前途的替代品之一。

在这八种甜蛋白中，Thaumatin发展最成熟、商业化程度最高，天然Thaumatin提取自西非的热带雨林植物翅果竹芋(Thaumatococcus daniellii)。同质量下，其甜度是蔗糖的1600倍，是一种低热量甜味剂。Thaumatin的两种主要亚型(III)均由207个氨基酸残基的多肽链组成，相对分子量约为22kDa，其中thaumatin II目前研究和应用最为广泛。Thaumatin不会引起龋齿，糖尿病患者也可以放心使用。此外，thaumatin在体内的代谢过程与其他食用蛋白一致。粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会、联合国粮食及农业组织和世界卫生组织(1986)的报告称，这种蛋白质没有任何毒性、基因毒性或致畸作用。多个欧美国家已经批准其作为甜味剂及风味调节剂使用。由于thaumatin甜味产生较慢，且保持较长时间的甘草余味，其常常被用于冰淇淋、饮料、奶制品、口香糖和动(宠)物饲料等的添加剂。

由于天然thaumatin产自西非热带植物的种皮中，提取这些甜蛋白代价过于高昂，世界各地的多个研究者的引进计划均已失败告终。由于天然生产thaumatin非常困难，因此全球各地有大量的使用重组DNA技术生产，目前已有多个相关报道，主要宿主有大肠杆菌、真菌、酿酒酵母、丝状真菌等。原核生物表达的重组蛋白常常因为不能正确折叠以及没有糖基化修饰等而低活性或无活性。真菌等表达系统可以正确地对表达产物进行翻译后修饰，但是依然面临着重组蛋白分离纯化问题。

动物乳腺是一种天然的高效的蛋白质合成器官，其合成的蛋白质与天然哺乳动物蛋白质的结构与性质非常类似。哺乳动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白质的翻译后修饰(如糖基化、β-羟基化、γ-羟基化、β-羧基化等)以及空间折叠比其他生物反应器生产的与人类天然蛋白质更加接近，所以生产出的重组蛋白非常接近于人源天然蛋白质，具有高活性、低抗原性和高稳定性的优点，与人体有更好的相容性，无论是作为食物或药物用于人体更加有效安全。目前尚无使用转基因动物乳腺生物反应器表达植物源重组thaumatin的报道。

发明内容