[发明专利]牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞

说明书

本发明提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞。本发明提供了悬浮MDBK细胞，在此基础上建立了悬浮培养IBRV抗原病毒液的方法，采用该方法所得的IBRV抗原病毒液具有抗原含量高、抗原批量大、批次稳定等特点，而且避免了因培养基中加入的牛血清引起的副反应，在节约经济成本的同时又能生产出更加安全和高效的疫苗。同时本发明的IBRV与MB二联灭活疫苗一针可防两病，简化免疫程序，减少了动物的免疫次数，降低了动物的应激，也节省了劳动力，进一步降低了动物养殖的成本。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域中一种牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞。

背景技术

牛肾细胞(MDBK)是一株来源于表观正常的牛的肾脏的传代细胞系，其通常在含有胎牛血清的培养基中进行贴壁生长，其对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻/粘膜病毒(BVDV)等多种病毒均较为敏感。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)又称牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)，可引起奶牛及肉牛高热、食欲不振、咳嗽、流鼻涕和结膜炎等症状，导致牛传染性鼻气管炎。

牛支原体(MB)可引起牛呼吸系统相关疾病，如支气管肺炎，喉炎，咽炎等，同时牛支原体还可引起牛的乳房炎和关节炎，其与IBRV均是引起牛呼吸道综合征 (BRDC)的主要病原。

目前预防牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体感染的有效手段是免疫牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体的灭活疫苗。目前关于牛支原体疫苗的CN110420323A、CN109022314A、CN107050451A等专利文献均为单苗，有关IBRV疫苗的 CN106729692B等专利文献均未涉及牛支原体的预防，若要同时防控这两种病原需要分别免疫，这既增加了动物的应激，同时也影响了疫苗的使用效果。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何制备抗原含量高、抗原批量大和/或批次稳定的疫苗；如何避免牛血清引起的副反应；和/或如何简化免疫程序，减少动物的免疫次数，降低动物的应激。

本发明的第一个目的是提供牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗的制备方法，包括：

1)用悬浮MDBK细胞培养牛传染性鼻气管炎病毒，得到牛传染性鼻气管炎病毒液，将所述牛传染性鼻气管炎病毒液进行灭活，得到灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液；用液体培养基培养牛支原体，得到牛支原体液，将所述牛支原体液进行灭活，得到灭活的牛支原体抗原液；

所述悬浮MDBK细胞按照包括如下步骤的方法制备：将贴壁MDBK细胞以低血清悬浮培养基传代培养，再以无血清悬浮培养基传代培养，获得生长性能好而且稳定的无血清悬浮培养MDBK细胞系，即为悬浮MDBK细胞；

所述低血清悬浮培养基是胎牛血清的体积含量为3％的液体培养基；所述无血清悬浮培养基是不含血清的液体培养基；

2)将所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分，得到牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

上述方法中，所述牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗为将所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分，和佐剂以一定比例混合，得到的牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

上述方法中，所述贴壁MDBK细胞为在含有10％胎牛血清的培养基中进行贴壁生长的牛肾细胞(MDBK)。

上述制备方法中，所述IBRV具体可用IBRV-SZH株；所述MB具体可用牛支原体PD株。