[发明专利]一种检测大豆线虫的引物和探针及方法

权利要求书

1.一种检测大豆线虫的引物和探针，其特征在于，包括如下核苷酸序列：

(1)检测线虫病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)检测胞囊线虫的探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)检测结线虫的探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求检测大豆线虫的引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的3’端修饰Biotin；

SEQ ID NO：3所示序列的5’端修饰FITC；

SEQ ID NO：4所示序列的5’端修饰DIG。

3.根据权利要求1所述的检测大豆线虫的引物和探针，其特征在于，所述的大豆线虫包括：Heterodera glycines、Heterodera sojae、Meloidogyne incognita、Meloidogynejavanica、Meloidogyne arenaria。

4.权利要求1或2所述检测大豆线虫的引物和探针在制备大豆线虫检测试剂中的应用。

5.一种检测大豆线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的核糖体DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板、SEQ ID NO：1～2所示的序列为引物进行PCR扩增，其中，SEQ ID NO：1～2所示的序列的3’端修饰Biotin；

(3)向步骤(2)得到的PCR产物中分别加入SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探针，其中SEQ ID NO：3所述序列的3’端修饰FITC，SEQ ID NO：4所示序列的3’端修饰DIG，梯度退火杂交；

(4)将步骤(3)得到的杂交液与展开液混合，滴在大豆线虫病的核酸层析试纸上，所述大豆线虫病的核酸层析试纸上设有检测线1、检测线2、质控线，其中检测线1喷涂抗FITC的抗体，检测线2喷涂抗DIG的抗体，质控线喷涂生物素；

(5)若质控线、检测线1显色，检测线2不显色，则判定待测样品中含有大豆胞囊线虫；

若质控线、检测线2显色，检测线1不显色，则判定待测样品中含有大豆根结线虫；

若质控线显色，检测线1、检测线2不显色，则判定待测样品中不含有大豆胞囊线虫或大豆根结线虫；

若质控线不显色，判定结果无效。

6.根据权利要求5所述的检测大豆线虫的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR体系如下：1μL DNA、2μL dNTP、2μL DreamTaq缓冲液、0.3μL Dream Taq、SEQ ID NO:1和2所示的引物各1μL、13μL双蒸水；

PCR条件如下：94℃变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min，冷却至12℃。

7.根据权利要求5所述的检测大豆线虫病的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的核酸层析试纸包括：样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸收垫(7)、固定板(8)；所述的样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸收垫(7)通过压敏粘合剂依次组装在固定板(8)上；

所述的样品垫(1)是检测样品的滴加位置，其材质为纤维素，制作核酸层析试纸前将样品垫置于样品垫处理液中静置10min，取出后置37℃烘干，密闭保存备用，所述的样品垫处理液的配方如下体积分数的物质：0.5％Tritonx-100、0.5％BSA、1％Tween-20溶于0.01M的PBS，调至PH8.0；

所述的结合垫(2)为胶体金结合垫，所述的胶体金结合垫的材质是玻璃纤维，制作前将结合垫置于链霉亲和素修饰的纳米金颗粒中的浸涂，然后37℃烘干备用；

所述的层析膜(3)的材质是高分子硝酸纤维素膜，层析膜(3)上喷涂有检测线1、检测线2、质控线，其中检测线1喷涂抗FITC的抗体，检测线2喷涂抗DIG的抗体，质控线喷涂生物素，其中所述检测线1、检测线2、质控线间间距0.6cm；

所述的吸收垫(7)用于吸收检测后的样本，其材质为纤维素，

所述的固定板(8)为样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸收垫的(7)背衬底板。