[发明专利]一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用

权利要求书

1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：

(1)将分离洗净的肿瘤组织剪碎，稀释；

(2)将稀释液与透明质酸酶、DNA酶和Ⅱ型胶原酶混合，消化，过滤，离心收集细胞沉淀；

(3)去除细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；

(4)最后用淋巴细胞分离液去除肿瘤细胞，得到肿瘤浸润淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(1)所述将分离洗净的肿瘤组织剪碎是指剪碎至尺寸小于1mm×1mm×1mm的颗粒；

优选地，步骤(1)所述稀释使用的试剂包括含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基。

3.如权利要求1或2所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(2)所述透明质酸酶为质量浓度为0.6-0.8％的透明质酸液；

优选地，步骤(2)所述DNA酶为质量浓度为0.15-0.25％的DNA酶液；

优选地，步骤(2)所述Ⅱ型胶原酶为质量浓度为1.1-1.3％的Ⅱ型胶原酶液；

优选地，步骤(2)所述稀释液、透明质酸液、DNA酶液和Ⅱ型胶原酶液的体积比为(40-50):(2-3):(2-3):(5-6)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(2)所述消化的温度为35-40℃，时间为4-6h；

优选地，步骤(2)所述过滤使用80-120目钢筛；

优选地，步骤(2)所述离心的速度为1500-2000rpm，时间为3-6min。

5.如权利要求1-4中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(3)所述去除红细胞的方法为：将细胞沉淀与红细胞裂解液混合，离心收集细胞沉淀；

优选地，所述离心的速度为700-900rpm，时间为3-8min。

6.如权利要求1-5中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(3)所述去除成纤维细胞和纤维细胞的方法为：将细胞沉淀用含10％的FBS完全培养基重悬后置于培养皿，培养40-45min使细胞贴壁，吸取除贴壁以外的悬浮细胞，重复该贴壁方法，离心取细胞沉淀；

优选地，所述重复的次数为2-5次；

优选地，所述离心的速度为700-900rpm，时间为2-4min。

7.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(4)所述用淋巴细胞分离液去除肿瘤细胞包括：

将步骤(3)得到的细胞沉淀重悬，细胞悬液铺于淋巴细胞分离液上，离心，取细胞分离液上层界面的白色云雾状细胞层，即为肿瘤浸润淋巴细胞。

8.如权利要求7所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述离心的速度为1600-2000rpm，时间为15-25min；

优选地，得到肿瘤浸润淋巴细胞后洗涤，用含有10％FBS和浓度为1000IU/mL rIL-2的完全培养基培养。