[发明专利]一种腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用

说明书

本发明涉及一种腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：(1)无菌收集肿瘤患者腹水，离心收集细胞沉淀；(2)去除细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；(3)用含有FBS和rIL‑2的完全培养基对细胞进行培养，收集悬浮细胞；(4)最后用淋巴细胞分离液对悬浮细胞进行分离纯化，得到腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞。本发明所涉及的腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法简单易操作，分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞增殖能力强，经体外rIL‑2活化扩增后，细胞数量迅速增多；纯度高，几乎达到100％；CD8⁺T细胞占比高达25.7％，对肿瘤细胞显示出良好的抗瘤活性。

技术领域

本发明属于细胞分离与培养技术领域，涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用，具体涉及一种腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用。

背景技术

TILs(肿瘤浸润淋巴细胞)是存在于肿瘤间质内的具有抗原特异性的以淋巴细胞为主的致敏淋巴细胞群体。TILs经体外生物制剂如重组人白介素-2(rIL-2)刺激活化后，其生长扩增能力和杀瘤活性均明显增强。一般来说，新鲜制备的原位TIL中绝大多数为T细胞。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例有显著差异。除黑色素瘤、头颈部肿瘤外，其他肿瘤中以CD8+T细胞为主。新鲜分离的TIL中CD25+细胞百分率较低，随着体外加IL-2培养时间的延长，CD25+细胞百分率逐渐升高。NK细胞的标记(CD16、CD56)在TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。因此，TIL在多种肿瘤中具有抗自身肿瘤的特异性，可望为今后更有效地进行肿瘤的生物治疗甚至预防提供强有力的依据和新的途径。

目前针对肿瘤浸润淋巴细胞的常规分离，主要有机械分离法、组织块培养法和酶消化法。其中，机械分离法是最早用于提取TIL的方法，但由于机械作用力容易使细胞死亡，得率低逐渐被淘汰；组织块培养法主要适用于活检标本，体积小而且肿瘤微环境相对完整，但得率也较低；酶消化法是较普遍采用的提取方法，但提取效果受很多因素影响，比如组织切碎程度、消化酶的组成、消化温度与消化时间等。

CN104762261A公开了一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，该方法是将肿瘤组织块加入至胰酶消化液浸泡、孵育，使肿瘤组织块充分消化打散；分离、收集单个细胞经胰酶消化液重悬后进行多次密度梯度离心，再以红细胞裂解液孵育、离心，用含小牛血清的PBS缓冲液重悬；得到溶解的肿瘤浸润淋巴细胞。

CN110042080A公开了一种原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养及体外扩增方法，取无菌新鲜肿瘤癌巢和癌旁组织，通过混合酶溶液进行消化分离，并接种于共刺激培养基中，从而实现淋巴细胞的培养和体外扩增。

但现有技术中关于肿瘤浸润淋巴细胞分离方法的报道大多针对的是实体肿瘤来源的肿瘤浸润淋巴细胞，而关于如何更科学有效地分离腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的策略还鲜少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用，具体提供一种腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：

(1)无菌收集肿瘤患者腹水，离心收集细胞沉淀；

(2)去除步骤(1)细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；

(3)用含有FBS和rIL-2的完全培养基对步骤(2)得到的细胞进行培养，收集悬浮细胞；

(4)最后用淋巴细胞分离液对步骤(3)悬浮细胞进行分离纯化，得到腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞。