[发明专利]一种基于KASP技术检测分子标记的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为分子标记检测方法，尤其涉及一种基于KASP技术检测分子标记的方法。所述的分子标记为非SNP和InDels；所述的步骤为：在标记扩增目标DNA序列内部设计KASP引物；对于共显性标记，有两条目标DNA序列，需要设计3条引物，包括2条位点特异引物和1条共用引物；对于显性标记，仅有一条目标DNA序列，需要设计2条引物，包括1条位点特异引物和1条共用引物；所述的位点特异引物的3’端为SNP位点，引物Tm值比KASP接头序列Tm值高1度以上，扩增片段大小为170±130bp。本发明所述的方法拓宽了KASP技术的检测范围；实现对STS或SCAR的快速检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为分子标记检测方法，尤其涉及一种基于KASP技术检测分子标记的方法。

背景技术

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。该项技术可以对广泛存在于基因组DNA中的SNPs或InDels进行精准的判断，是一种高通量、低成本、低失误率的SNP分型技术。而且KASP标记可避免实验室凝胶电泳，实现自动化、平台化操作，具有高通量、低成本、遗传稳定性好等特点。鉴于此特点，KASP标记目前已经在小麦基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了重要作用。得益于近年来小麦近缘种属植物基因测序信息的不断完善，小麦背景下追踪外缘物质也不断有成功的报道。

目前用于已知基因辅助选择的分子标记类型主要包括SNP、STS、SCAR等，其中SNP(包括Indel)可以用KASP技术进行检测(Semagn K, Babu R, Hearne S, et al. Singlenucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR(KASP): overview of the technology and its application in crop improvement[J]. Mol Breed, 2014, 33: 1-14.)，而STS、SCAR和其他分子标记的检测仍采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳检测一般需要经过凝胶制备、点样、电泳、染色和照相等多个步骤，过程复杂且容易出错，花费时间也较长。

发明内容

为了简化分子标记的检测，实现自动化检测，本专利发明了一种基于KASP技术检测分子标记的方法；分子标记为非SNP和InDels。通过本发明的方法可以扩宽KASP技术的检测范围。且提高非SNP和InDels的分子标记的检测工艺，实现了批量化和自动化检测。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于KASP技术检测分子标记的方法，所述的分子标记为非SNP和InDels；

包括以下步骤：在标记扩增目标DNA序列内部设计KASP引物；对于共显性标记，有两条目标DNA序列，需要设计3条引物，包括2条位点特异引物和1条共用引物；对于显性标记，仅有一条目标DNA序列，需要设计2条引物，包括1条位点特异引物和1条共用引物；

所述的位点特异引物的3’端为SNP位点，引物Tm值比KASP接头序列Tm值高1度以上，扩增片段大小为170±130bp。

优选地，所述的分子标记为STS或SCAR。

上述的方法，具体包括以下步骤：

（1）寻找相似序列：将标记扩增目标DNA序列与参考基因组进行BLAST比对，找到基因组中与目标DNA相似度85%的序列并下载；