[发明专利]一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法

说明书

本发明提供了一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，将发育到适宜时期的游离小孢子胚状体转入成苗培养基，先在10℃低温下诱导处理，再在正常光照条件下培养形成再生幼苗；切取再生幼苗转入生根培养基，连续光照培养使其壮苗生根；当再生植株长到3~5片真叶并具有健壮根时，置于密封的塑料小拱棚进行驯化，成活后移栽到温室。本发明还提供了一种胚状体成苗培养基，在该培养基上人参小孢子胚状体能很好地萌发并直接、快速地再生幼苗。本发明从培养条件、培养基成分等方面，初步研究了若干因素对胚状体发育成苗的影响，成功获得了人参单倍体再生植株，为游离小孢子培养在人参育种方面的应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，属于中药植物培育技术领域。

背景技术

人参（Panax ginseng C. A. Mey）为五加科人参属多年生草本植物，主根肥大，肉质黄白色，圆柱形或纺锤形，下部常带有分支，须根长且多。人参通常3年开花，5~6年结果，花期7~8月，果期6~9月，种子可阴干贮藏，种胚有后熟特性，没有完成生理后熟的种子不发芽。人参怕晒、怕热、怕旱、耐寒，喜阴凉、湿润的气候，多生长在杂木林或针阔混交林中。人参在我国主要分布于辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部，其中主产区为吉林省抚松、靖宇、长白朝鲜族自治县，有“人参故乡”之称。作为我国传统名贵中药材之一，人参根、茎、叶、花及果实均可入药，具有大补元气、益气生津、延年益寿等诸多功效。我国现存最早的药物学专著《神农本草经》中对人参的药理学作用有这样的描述：“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，明目，开心益智”，“久服轻身延年”。目前对人参成分研究主要集中在皂苷类、多糖类和挥发性成分，其中人参皂苷是人参中主要的活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗心肌缺血、抗衰老、改善记忆力等广谱的药理活性。

在我国，人参育种工作虽然起步较早，但发展缓慢。育种周期长、变异类型不稳定、混杂程度高是影响其发展的主要瓶颈。若采用单倍体育种和常规育种相结合的方法，势必能大大缩短育种年限，加快人参育种进程，满足人们的用参需求。

单倍体材料可以通过自然发生和人工诱导获得。自然产生单倍体一般突变数量少，频率低，难以在生产实践中应用。人工诱导单倍体的方法主要有：一是雄核途径，包括花药培养、小孢子培养等；二是雌核途径，包括未授粉子房（或胚珠）培养、化学药剂诱导、辐射花粉授粉等。其中花药或小孢子培养应用最为广泛。

花药培养是指在适宜培养基上进行花药诱导培养，使花粉由配子体途径转为孢子体途径发育，诱导分化形成再生植株。在花药培养过程中，由于受体细胞因子（花药壁、药膈、绒毡层）的影响，培养物混倍现象普遍存在。特别是由愈伤组织分化而来的植株，往往是单倍体、二倍体、三倍体、四倍体、多倍体、杂合体等组成的混合群体。而游离小孢子培养是由分离的单细胞直接发育成胚胎，因此是快速获取植物纯合单倍体的最有效途径，可在短期内得到大量高度纯合的单倍体植株，能快速纯合基因型，增加选择机率，加快育种进程，并为下一步的杂种优势利用打下基础。Chuong等发现油菜小孢子培养比其花药培养的胚状体发生率高 20倍以上；栗根义等发现大白菜小孢子培养胚胎的诱导效率比花药培养高出10倍以上；Davies等比较了大麦的游离小孢子培养和花药培养，发现前者较后者产生更多的正常再生植株。游离小孢子培养可剔除体细胞的影响，培育出的是纯合的单倍体植株，再通过加倍易于获得纯合的二倍体，同时其胚胎发生率可能会比花药培养更高，因此在植物育种和遗传改良中具有诱人的前景。

游离小孢子培养是在离体培养的条件下改变作物花粉的正常发育方向而形成单倍体植株。在这个过程中，小孢子容易受到各种因素的影响和控制。其中，内因主要包括供体植株的基因型，取材时期等；外因主要包括环境条件、材料预处理、培养基类型、培养基添加物、培养密度等。目前游离小孢子培养在育种中取得较好进展的有芸薹属作物（大白菜、甘蓝、油菜等）、禾本科作物（小麦、大麦、水稻）等，而人参游离小孢子再生体系还未建立，这表明人参游离小孢子培养难度较大，同时也说明其小孢子培养技术较滞后。

发明内容