[发明专利]红嘴鸥IFNα蛋白克隆表达及多抗制备

权利要求书

1.一种红嘴鸥IFNα蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

2.一种编码红嘴鸥IFNα蛋白的基因，其特征在于：所述基因编码如权利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.一种红嘴鸥IFNα克隆表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）分离红嘴鸥血液淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转录为cDNA；

2）设计扩增引物，PCR扩增获得红嘴鸥IFNα基因部分片段；

3）将pMD18-T载体与纯化的IFNα基因部分片段进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α进行培养，将培养后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoR I与Xho I双酶切方法进行双重鉴定，获得重组质粒pMD18-T-IFNα-1；

4）用EcoR I与Xho I酶切重组质粒pMD 18T-IFNα-1，获得目的片段IFNα-1。

4.根据权利要求3所述的红嘴鸥IFNα克隆表达的方法，其特征在于：还包括以下步骤：

5）重组原核表达载体的构建

将目的片段红嘴鸥IFNα-1插入pET32a(+)载体的EcoR I和Xho I酶切位点之间，构建得到重组原核表达载体pET32a-IFNα-1。

5.根据权利要求3或4所述的红嘴鸥IFNα克隆表达的方法，其特征在于：步骤2）中，扩增引物序列如下：

F：GAA TTC CTG CTC CTC CTG ACG GCT ；

R：CTC GAG CTA ATT GCA CAT GGT GCG GGT GAG；扩增片段大小为537bp。

6.根据权利要求3-5任一项所述的红嘴鸥IFNα克隆表达的方法，其特征在于：步骤2）中，PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延展1min，35个循环；72℃ 延展10min。

7.一种红嘴鸥IFNα蛋白的制备方法，其特征在于：将权利要求4、5或6制备的红嘴鸥IFNα原核表达载体转化至Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导表达，获得红嘴鸥IFNα重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的红嘴鸥IFNα蛋白的制备方法，其特征在于：菌液OD₆₀₀值约0.5-0.6时，诱导表达条件为加入1 mmol/ml IPTG于37℃条件下诱导表达5h。

9.一种红嘴鸥IFNα多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1-8任一项获得的红嘴鸥IFNα蛋白作为抗原免疫兔子，接种方法如下：

1）免疫原的准备：首免时将蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，在冰上超声乳化5min，在进行二免和三免时蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合后在冰上超声乳化30min；

2）免疫程序：一免：完全佐剂+抗原，抗原注射剂量为1mg/只，足底皮内注射；二免：不完全佐剂+抗原，抗原注射剂量为1mg/只，腹部皮内注射；三免：不完全佐剂+抗原，抗原注射剂量为1.5mg/只，脊背、腹部皮下注射；

3）在三免后14天颈动脉放血，分离血清即可得多克隆抗体。

10.一种红嘴鸥IFNα多克隆抗体，其特征在于：该多克隆抗体根据权利要求9的方法制备得到。