[发明专利]一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法及其应用；本发明首先通过特殊培养方法构建永生化小鼠肺癌mLU6054‑KRAS‑G12D细胞模型；然后在此基础上，使用CRISPR‑Cas9基因编辑方法将LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054‑KRAS‑G12D‑MLKBKO的特异型细胞模型；最后通过Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型，使之成为一个稳定可靠的模型，用于KRAS‑G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肺癌KRAS 突变细胞模型的构建方法及其应用。

技术背景

据2019年报告显示，2015年全国恶性肿瘤发病约392.9万人，较2014年的380.4万增加12.5万，增长率为3.2％。从发病人数看，肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位，发病人数为78.4万。

2015年全国恶性肿瘤死亡例数约为233.8万例，较2014年的229.6万4.2万，增长率为1.8％。肺癌位居我国恶性肿瘤死亡第1位， 2015年我国因肺癌死亡人数约为63.1万例，死亡率为45.87/10万。

肺癌研究表明，50％的非小细胞肺癌的发生是由于一系列的驱动基因，包括EGFR，KRAS,ALK,Akt,MEK,PI3K,BRAF等。其中最常见的为EGFR和KRAS突变。过去十年里，疾病驱动基因包括 EGFR、ALK、ROS-1和BRAF以及靶向药物研发的进步，非小细胞肺癌的治疗取得了巨大的进展。然而，一个主要驱动基因仍没有相应的靶向治疗药物，那就是KRAS。KRAS基因已证实在约25％的非小细胞肺癌(NSCLC)中扩增，但仍没有成功的靶向KRAS药物临床应用于临床。

而对EGFR的靶向药物治疗中，KRAS如果突变，也会导致耐药性。

所以KRAS的突变细胞模型对于药物研究和开发具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种构建肿瘤细胞模型mLU6054-KRAS-G12D-mLKB1KO工程细胞系的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

1)构建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D细胞模型；

2)使用CRISPR-Cas9基因编辑方法将步骤1中的细胞模型中的 LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特异型细胞模型。

上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤2 之后还包括步骤3：通过Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型。

上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤1 具体包括以下详细步骤：

a)处死小鼠：将mLU6054鼠源肺癌移植瘤块的荷瘤小鼠脱颈处死，裸鼠浸泡入75％酒精消毒五分钟，非裸鼠浸泡10分钟；

b)剥取荷瘤：用眼科镊子和剪刀小心剥取瘤，迅速将瘤组织完全浸泡在带双抗的PBS中，并给瘤块编号，称重；