[发明专利]使人胚胎干细胞分化成间充质干细胞的诱导培养基

说明书

本发明提供了一组人胚胎干细胞(hESC)分化成间充质干细胞(MSCs)的诱导培养基，所述培养基包括原条(PS)细胞诱导培养基、外侧中胚层诱导培养基和MSCs诱导培养基。采用所述诱导培养基使hESC诱导分化成MSCs，主要涉及三个阶段，包括PS细胞的诱导，向外侧中胚层细胞的分化以及MSCs的分化。通过所述诱导培养基进行分阶段分化，整个分化过程可以追踪并质控，成本较低，且操作简单；获得hESC诱导分化成MSCs的中间产物，包括PS细胞、外侧中胚层细胞和MSCs；可以高效产生数量更多的MSCs，倍增时间更短，并且可重复，最短仅需17天即可获得成熟的MSCs；其中前两个阶段的分化诱导培养基为成分明确的无血清培养基，使分化出来的MSCs免受外源物质的污染，保证了其均一性和临床适用性。

技术领域

本发明涉及生物与医药技术领域，具体而言，本发明涉及使人胚胎干细胞(hESC)分化成间充质干细胞(MSCs)的诱导培养基。

背景技术

MSCs由于具有多向分化能力和免疫调节特性(Le et al.，2012)，已被尝试用于治疗多种外伤性、退行性、炎症性疾病(Shi et al.，2018)和肿瘤，如关节软骨损伤、移植物抗宿主病和心肌缺血等等。可应用的MSCs来源广泛，几乎在所有成体结缔组织中都可以分离出，例如脐带、外周血、羊膜、子宫内膜、体液、胎盘、骨髓、脂肪和牙髓等。然而，成体来源的MSCs受细胞数量、异质性和生物安全性等问题的限制，限制了其临床治疗应用潜力的发挥。不仅如此，成体来源的MSCs也有传播供体病原体(Parekkadan et al.，2010)和遗传性疾病的风险。近年来，许多文章已经报道可以将人胚胎来源的干细胞(hESCs)诱导分化产生MSCs，为其用于临床治疗提供可能性。

人胚胎干细胞来源的MSCs(hESC-MSCs)具有与人成体来源的MSCs相似的生物学特性和功能。相对于成体来源的MSCs来说，hESC-MSCs具有以下优点：(1)来源无限并且一致，不受细胞数量的限制；(2)具有更高的纯度和更快的增殖速度；(3)具有较低的免疫原性，即更高的免疫安全性；(4)不受供者年龄和原有疾病(尤其是遗传性疾病)的影响；(5)可以像药品一样，事先备好，随取随用，易质控。

现有的从ESC产生MSCs的方法主要有：OP9共培养法(Barberi et al.，2005，Olivier et al.，2006)、三维胚状体(EB)诱导法(Brown et al.，2009，Wei et al.，2012)和培养基直接诱导法(Gonzalo-Gil et al.，2016，Harkness et al.，2011)。这些方法尽管取得了一定的进展，但大多数策略都需要费力的操作，包括刮取、手工挑选、细胞分选或连续传代(Fukuta et al.，2014；Gibson et al.，2017；Kopher et al.，2010)，培养时间长等，仍然存在局限性。而且在采用的培养基方面，全过程采用同样的培养基进行粗放性培养，无法对中间过程进行精准质控；此外，培养基中还使用未明确的成分(例如胎牛血清或OP9饲养细胞)，导致不同批次间分化的细胞质量差异，进而极大地损害临床适用性(Barberi et al.,2005,Hwang et al.,2008,Olivier et al.,2006)。

CN104487568B公开了一种利用胚胎干细胞经过中间产物滋养细胞分化成MSCs的方法，并且所述分化的滋养细胞进而向hESCs-T-MSCs或T-MSCs分化。方法采用的hESCs需在已被辐射的小鼠胚胎成纤维细胞做饲养细胞的条件下培养(见实施例1)，对后期的细胞移植存在潜在的动物来源抗原成分或病原体传播的危险性；在采用的培养基方面，由于从滋养层细胞分化到MSCs过程中采用统一培养基，无法对从滋养层细胞分化到MSCs过程中的中间产物阶段Pre-T-MSC进行质控，因此导致分化过程难以稳定，难以得到质量均一的MSCs。