[发明专利]一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法

说明书

本发明提供了一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法，该酿酒酵母菌株为SEB14，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19587。本发明以工业酿酒酵母菌株RHZ‑1为出发菌株，对其进行ARTP诱变和多轮基因组重排，通过TTC显色反应、杜氏导管、三角瓶发酵等对突变菌株进行筛选，最终获得一株优秀的多重耐受性菌株SEB14。SEB14具有较好的耐高温性能、乙醇耐受性、高糖耐受性和耐高渗性能，具有较好的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及微生物重组技术领域，尤其涉及一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的 多重耐受性发酵菌株及构建方法。

背景技术

生物乙醇年产量已超过500亿升，成为一种生态友好的可再生能源，提高生 物乙醇产量和经济效益可以促进其进一步的应用和开发。在当前的工业发酵中, 超高浓度(VHG)乙醇发酵(培养基含糖量大于250g/L以期获得15％以上的乙 醇)和同步糖化发酵(SSF)被认为是一种有效、节能、和广泛应用的工业乙醇 生产工艺。然而，在工业生产中，许多环境压力，包括乙醇，高温，渗透压力， 所有这些外界胁迫将同时和持续的作用于酵母细胞，成为乙醇生产的重要瓶颈之 一。

为了提高乙醇产量，构建具有多种环境胁迫耐受性的优良工业酿酒酵母菌株 至关重要。然而，目前的研究主要集中在酿酒酵母单一耐受性的提高，而如何提 高酿酒酵母的多耐受性的研究非常有限。酿酒酵母的耐受性表型与复杂的代谢网 络有关，其中包括多种调控系统且和广泛分布于整个基因组的基因有关。因此， 基因工程等手段对于多重耐受性能的提升效果不佳。相反，紫外诱变、单倍体杂 交和基因组重排等育种方法已被成功应用于获得多重耐受性酵母。尽管这些研究 都取得了一定成果，但这些菌株在工业生产中的应用仍存在一些局限性。其中， 大多数研究采用性能较易改变的实验室酵母作为原始菌株，不适合工业化生产条 件。另外，目前所获得的多重耐受性菌株发酵能力仍不理想，需要进一步提升。

综上所述，目前需要一种产乙醇量高的多重耐受性菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一株耐乙醇、耐高温、耐 高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法，以耐温工业菌株为出发菌株，主要采用ARTP诱变与基因组重排相结合的新策略，构建多重耐受性的工业酿酒酵母菌株。 首先，通过ARTP诱变分别得到耐乙醇突变菌株和耐高温突变菌株。然后分别对 耐乙醇和耐高温突变菌株进行四轮和三轮基因组重排。最后将最佳的耐乙醇菌株 和耐高温菌株进一步杂交，经过一系列筛选，获得一株耐乙醇、耐高温、耐高渗 的多重耐受性菌株SEB14。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌 株，其为SEB14，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为 CGMCCNo.19587，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。

本发明的第二方面是提供上述耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌 株的构建方法，包括如下步骤：

步骤一，构建出发菌株：将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得 絮凝性融合子RHZ-1；

步骤二，ARTP诱变处理及菌株筛选：

(1)对上述RHZ-1进行预培养，然后再培养至菌株RHZ-1处于对数生长期 与稳定期之间的过渡期；

(2)取处于过渡期的RHZ-1的菌液，离心，取上清，加入1mL EDTA和 5％甘油混合溶液打散菌体制备菌悬液；取菌悬液均匀涂抹至几个照射玻片上进 行照射，将照射后的玻片放入生理盐水中混匀、保存得到混合菌液；