[发明专利]SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF细胞中的应用

说明书

本发明公开了SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF细胞中的应用，将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂。本发明采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究。

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF中的应用。

背景技术

脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性限制了其临床应用；间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中,它是一种具有多向分化潜能的细胞,具有促进组织再生的潜能。研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs,而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点，传统的化学消化法所分离获得基质血管片段(SVF)为细胞悬液,并非黏附在细胞外基质(ECM)上的生理状态,所以移植后ASCs易被宿主巨噬细胞吞噬,使成熟脂肪细胞和ASCs均不能长久成活,这是导致脂肪移植保留率不稳定的主要原因。现有技术公开了一种SVF提取用试剂盒，包括内身、盒套、副盒体和外盒。内身和盒套构成主盒体。内身的上端面上开设第一凹槽，在该第一凹槽的底面上开设一个离心管放置腔、两个过滤器放置腔、一个广口瓶放置腔及一个滴管放置腔；盒套由顶面、底面及宽度方向的两侧面构成，使内身从盒套的长度方向的任意一个敞开面能插入盒套的内腔；该盒套的顶面开设七个第一插孔和一个第二插孔，该盒套的底面开设七个第三插孔；副盒体的上端面开设第二凹槽，在该第二凹槽的底面上开设两个试剂瓶放置腔；外盒包括底盒和可开启的盒盖，使试剂盒保持密封状态；不仅便于携带仪器和试剂，更能方便临床医护人员对SVF进行提取。现有技术一般采用胶原酶溶解脂肪后离心过滤，对细胞活性有较大影响。

发明内容

本发明提供SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF中的应用，得到的SVF细胞存活率高，其中SVF可以称为基质血管成分，优选脂肪基质血管成分。

本发明采用如下技术方案：

SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。

上述SVF提取试剂在提取SVF细胞中的应用。

本发明中，SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到；SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%、透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L，优选的，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸的浓度为1g/L。

本发明SVF提取试剂用于提取SVF细胞时，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。洗涤后的脂肪为现有技术，本发明的创造性在于提供新的SVF提取试剂，采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高；优选的，洗涤后的脂肪与SVF提取试剂的体积比为1∶1；消化为37℃消化1小时，进一步优选的，消化时振荡。

本发明中，洗涤液为生理盐水；生理盐水一般为0.9%生理盐水。

现有技术一般采用一种胶原酶或者再加入添加剂进行消化脂肪得到SVF细胞，存在胶原酶残留以及细胞过度消化的问题，尤其是加入白蛋白后，SVF细胞纯度不高；本发明采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性大、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究，比如关节炎药物的制备研究、软骨损伤药物的制备研究、美容药物的制备研究等。

附图说明

图1为本发明采集的脂肪图；

图2为本发明脂肪酶解消化同样；