[发明专利]化学成分明确的人气道上皮细胞无血清培养基及其应用

权利要求书

1.一种用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，其特征在于，包括MCDB153基础培养基、高氨基酸组合物和小分子组合物；

所述高氨基酸组合物包括L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸；

所述小分子组合物包括二丁酰环腺苷酸、重组成纤维生长因子1、重组表皮生长因子、重组胰岛素样生长因子1。

2.根据权利要求1所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，其特征在于，所述高氨基酸组合物包括50-800μM L-组氨酸、0.1-5mM L-异亮氨酸、10-500μM L-甲硫氨酸、10-500μM L-苯基丙氨酸、5-500μM L-色氨酸和10-500μM L-酪氨酸。

3.根据权利要求1所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，其特征在于，所述小分子组合物包括80-800μM二丁酰环腺苷酸、1-100ng/ml重组成纤维生长因子1、0.1-50ng/ml重组表皮生长因子、1-100ng/ml重组胰岛素样生长因子1。

4.根据权利要求1所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，其特征在于，所述小分子组合物还包括抗坏血酸、三碘甲状腺氨酸、乙醇胺、磷酸乙醇胺、转铁蛋白、氢化可的松、烟酰胺中的一种或任意组合。

5.根据权利要求4所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，其特征在于，所述抗坏血酸、三碘甲状腺氨酸、乙醇胺、磷酸乙醇胺、转铁蛋白、氢化可的松、烟酰胺的浓度依次为0-200μM、0-500pM、0-800μM、0-800μM、0-500nM、0-50μM、0-10mM。

6.一种配制权利要求1-5任一项所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基的方法，其特征在于，包括：

(1)配制高氨基酸组合物：称取各成分氨基酸，依次将在对应的溶剂中溶解，混匀，过滤，配制成储备液的浓度；再将各类氨基酸配制成100x的混合溶液，即100x HAA的储备液，作为MCDB153基础培养基的添加剂；同一批次的氨基酸添加物放置于4℃储存；

(2)配制小分子组合物：称取各类小分子化合物，溶解，混匀，配制成储备液的浓度；再将各类小分子配制成100x的混合溶液，即100x基础培养基的添加剂，作为MCDB153基础培养基的添加剂；同一批次的氨基酸添加物放置于-80℃冻存；

(3)取出高氨基酸组合物、解冻小分子组合物，分别按照稀释比例加入到MCDB153基础培养基中，得到用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基。

7.一种利用权利要求1-5任一项所述的无血清培养基培养人气道上皮细胞的方法，包括：得到人气道上皮细胞后，在细胞培养容器中加入权利要求1-5任一项所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基，然后接种人气道上皮细胞进行培养，待细胞培养容器内细胞融合度达到80％-90％后进行传代培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，肺科支气管镜检，刷头刮刷分离气道表皮，得到人气道上皮细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基中添加ROCK抑制剂后接种细胞。

10.根据权利要求1-5任一项所述的用于人气道上皮细胞体外扩增培养的无血清培养基、权利要求6所述的无血清培养基配制方法，权利要求7-9所述的培养人气道上皮细胞的方法在生物领域中的应用。