[发明专利]一种基于高粱的SbERECTA蛋白真核表达和激酶活性鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于高粱的SbERECTA蛋白真核表达和激酶活性鉴定方法，包括制备突变Sberecta、构建表达载体、诱导Sberecta和SbERECTA蛋白、纯化Sberecta和SbERECTA蛋白、对比试验反应、终止反应和激酶活性鉴定。本发明的有益效果是：提供对比组和不同浓度梯度的IPTG诱导Sberecta和SbERECTA蛋白分化，便于得到Sberecta和SbERECTA蛋白的最佳诱导浓度，确保数据的准确性，且在试验中容易观察到定位蛋白质的颜色变化，便于观察基因表达情况。

技术领域

本发明涉及一种激酶活性鉴定方法，具体为一种基于高粱的SbERECTA蛋白真核表达和激酶活性鉴定方法，属于生物技术领域。

背景技术

高粱作为一种重要的饲草作物和生物能源物质，其育种的创新与性状改良是解决耕地、人口、资源、能源与环境间矛盾的关键，ERECTA是一个类受体激酶家族，参与调控植物细胞分化和组织发育，增加植物蒸腾效率和植株生物量，是调控植物生长发育进程中一个关键候选基因，生物量是饲用高粱育种研究的重点，深入剖析SbERECTA对高粱生长发育和生物量的调控机理具有重要意义。

前期研究表明，SbERECTA基因在高粱花梗、子房等快速分化发育的幼嫩器官中大量表达，且仅在少数品种中表达水平较高，其表达水平与不同高粱品种叶片气孔密度、光合速率和单株鲜重显著相关，因此需要对SbERECTA进行深入研究和功能鉴定。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基于高粱的SbERECTA蛋白真核表达和激酶活性鉴定方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种基于高粱的SbERECTA蛋白真核表达和激酶活性鉴定方法，包括以下步骤：

步骤A：制备突变Sberecta，将SbERECTA激酶区关键赖氨酸突变为谷氨酸，获得突变Sberecta；

步骤B：构建表达载体，将pPICZaA-Sberecta和pPICZaA-SbERECTA进行重组，构建载体；

步骤C：诱导Sberecta和SbERECTA蛋白，利用IPTG在37℃的环境下诱导3h表达Sberecta和SbERECTA蛋白；

步骤D：纯化Sberecta和SbERECTA蛋白，用离子柱法纯化Sberecta和SbERECTA蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳检测和Western Blot分析；

步骤E：对比试验反应，按照实验设计分组分别加入不同物质进行对比分析；

步骤F：终止反应，电泳检测结束后，去除分离胶，考马斯亮蓝染色，脱色，压磷屏；

步骤G：激酶活性鉴定，4～24h后，Typhone扫描磷屏，观察分析GST-Sberecta和GST-SbERECTA活性。

优选的，为了方便诱导SbERECTA激酶区发生突变，便于后续对比试验的操作，可以更加直观观察ERECTA蛋白表达的效果，所述步骤A中，把SbERECTA激酶区赖氨酸的部分放在紫外线下照射，使其发生产生突变，基因的突变影响到细菌细胞代谢产物的改变，由原来产生赖氨酸的细菌变成了产生谷氨酸的细菌。

优选的，为了确保数据的准确性，提供对比组和不同浓度梯度的IPTG诱导Sberecta和SbERECTA蛋白分化，便于得到Sberecta和SbERECTA蛋白的最佳诱导浓度，所述步骤C中，将浓度为0mM/L、0.4mM/L和0.8mM/L的IPTG分别加入到Sberecta和SbERECTA蛋白的实验组和对照组中，并诱导其分化。