[发明专利]一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针，制备方法及其应用

说明书

本发明属于胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针、制备方法及应用。本发明所述的多肽探针将现有GPO多肽探针(Gly‑Pro‑Hyp)_n中间位置的Pro替换为Tyr或Phe，构建了包含芳香族氨基酸的两个新型多肽探针FAM‑GYO：FAM‑(Gly‑Pro‑Hyp)₃‑Gly‑Tyr‑Hyp‑(Gly‑Pro‑Hyp)₄和FAM‑GFO：FAM‑(Gly‑Pro‑Hyp)₃‑Gly‑Phe‑Hyp‑(Gly‑Pro‑Hyp)₄。所述多肽探针FAM‑GYO和FAM‑GFO显著降低了现有GPO探针的三重螺旋结构稳定性，并保持了与现有GPO探针相当的靶向结合病变胶原蛋白的能力，可以特异性结合小鼠不同组织中的变性胶原蛋白，并成功的应用于不同疾病样本的组织染色，在肿瘤、纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。同时，所述的多肽探针FAM‑GYO和FAM‑GFO长度较短，也没有引入复杂的非天然氨基酸，极大降低了探针合成的难度和成本。

技术领域

本发明属于胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针，制备方法及其应用。

背景技术

胶原蛋白是一组具有独特三重螺旋结构的细胞外基质蛋白。作为细胞外基质的主要组成成分，胶原蛋白在皮肤、骨骼、肌腱和韧带等结缔组织中普遍存在。它为组织发育提供了重要的结构支架，并介导了细胞粘附、增殖、迁移和分化等各种细胞行为。因此，胶原蛋白的重塑异常与癌症、纤维化和关节炎等各种关键疾病密切相关。胶原蛋白被认为是肿瘤微环境的关键成分，它可以影响肿瘤细胞的行为，增加肿瘤组织的硬度。大量的临床数据表明，胶原蛋白是癌症分化、侵袭、转移以及癌症分期的重要诊断标记物。胶原蛋白的合成和降解失衡已被发现是肺和肝纤维化的主要原因。因此，及时检测胶原蛋白对于了解这些疾病的发病机理和开发新的治疗方法至关重要。

目前，胶原蛋白的检测主要依赖于胶原蛋白抗体，其中基于ELISA的筛选发现了两种单克隆抗体E1E5和E4A11，用于特异性识别II型胶原蛋白。由于胶原蛋白的特殊三重螺旋结构，胶原蛋白抗体存在特异性不佳、亲和力弱的缺陷，并且其检测过程较复杂，重现性较差。最近发现了一种由重复的(Gly-Pro-Hyp)_n序列构成的GPO多肽探针，但是(Gly-Pro-Hyp)_n序列具有很强的三重螺旋结构稳定性，必须经过高温加热等预处理方法形成单链，才能特异性识别变性胶原蛋白。但是，高温加热预处理增加了组织的损伤风险，并且降温后的多肽探针又会重新折叠形成三重螺旋结构，因此，很难准确定量完全处于单链状态探针的浓度，这些缺陷极大的限制了GPO多肽探针的临床应用。

为了降低GPO多肽探针的三重螺旋结构稳定性，目前已经开发了多种方法。例如，中国专利CN110129029A公开了一种电荷排斥作用降低三重螺旋结构稳定性的胶原靶向多肽探针，它通过在GPO序列的一端修饰有多个带电荷的氨基酸获得。该设计增加了多肽探针的长度，加大了多肽探针的合成难度和成本。中国专利CN110129029A公开了一种通过在GPO序列中间位置引入大体积荧光团FAM，导致位阻效应从而降低三重螺旋结构稳定性的胶原靶向多肽探针。该设计需要引入非天然氨基酸Amp，显著增加了多肽合成的难度。

据文献报道，胶原蛋白特征性的(Gly-X-Y)_n序列中X和Y位置的氨基酸类型严重影响胶原多肽的三重螺旋结构稳定性。当X位置为Pro，Y位置为Hyp时，胶原多肽的三重螺旋结构最稳定；当X或Y位置的氨基酸变为其他类型的氨基酸，胶原多肽三重螺旋结构的稳定性会不同程度降低。虽然X和Y位置的氨基酸如此重要，但是目前所有的病变胶原靶向多肽探针都是基于仅包含Pro和Hyp的(Gly-X-Y)_n序列，因为氨基酸的细微变化可能会严重影响多肽探针对病变胶原蛋白的靶向结合能力，而Pro和Hyp的特殊结构可能对多肽探针特异性结合病变胶原蛋白的解链部分至关重要。