[发明专利]一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于不同副溶血弧菌菌株的tdh、trh、tlh及toxR基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的tdh、trh、tlh及toxR四种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种副溶血弧菌核酸检测质粒 DNA参考样品、制备方法及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，大量分布在近海岸的海水、海底沉积物和海产品中。目前，已成为许多沿海国家细菌性食物中毒的首位病原菌。同时也是引起我国沿海地区细菌性食物中毒的首位食源性致病菌，是全国食源性疾病微生物病因的主要致病物质之一。目前，由VP引起的食源性疾病已超过沙门氏菌，跃居于食源性致病菌的首位，成为当前世界上分布最广泛、最常见的疾病之一，是国内外极为重视的公共卫生安全问题之一。

VP致病性主要通过与宿主细胞的相互作用体现，一系列研究表明致病性 VP的毒力因子主要有溶血性毒素、脂多糖、尿素酶等。其中，溶血素类毒力因子包括耐热直接溶血素Tdh、不耐热直接溶血素Tlh、和耐热直接相关溶血素Trh，分别由tdh、tlh、trh基因编码。其中，Tdh能使人或兔红细胞发生溶血，称为“神奈川现象”，该现象常用于VP的传统检测方法。Trh具有与Tdh相似的毒性，如致死和肠毒素作用，但却缺乏溶血功能。近90％的临床分离株存在tdh、trh 基因或者两者皆有。Tlh和卵磷脂结合可以使羊的红细胞溶血。而ToxR是由一个跨膜调节蛋白的toxR基因编码，能刺激Tdh。

VP的检测方法主要分为传统检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法三类。传统检测方法要进行增菌、分离、生化鉴定、血清学鉴定及神奈川试验，虽然该方法成熟可靠，但操作繁琐、费时费力。免疫学检测方法主要通过过高特异性的抗体捕获目标菌，借由酶联免疫吸附反应、免疫色谱检测、免疫传感器等技术实现病原菌的富集和快速检测，该方法特异性强、检测效果好、灵敏度高于传统检测方法，但相比于分子生物学检测方法仍有不足。分子生物学检测方法主要有PCR法、LAMP、DNA杂交法、适配体传感器检测法等，该方法效率高、灵敏度高、特异性强，但对技术和设备要求较高。

目前，缺乏针对VP的核酸检测的质粒DNA参考物质，基因组参考品和各个试剂盒自行研制的小片段核酸是主要的参考物质，但是由于这些参考物质在量值和序列溯源方面无法统一，所以各实验室之间检测结果差异较大，缺乏可比性。

质粒DNA参考物质(pDNA)是一类含有所检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，具有稳定性好、准确度高的特点。它不仅可以在核酸的定性检测中作为阳性对照，还可在定量分析中作为定量标准，构建定量分析的标准曲线。因此，质粒DNA参考物质在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，提高VP核酸检测结果的可比性，为VP的核酸相关检测方面提供技术支持，解决病原核酸检测能力快速发展与缺乏参考材料之间的矛盾。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品，采用包含来源于不同副溶血弧菌菌株的tdh、trh、tlh及toxR全长基因的片段插入质粒中形成；

所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因以等比例串联；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因间以不相关的基因片段进行隔开。