[发明专利]一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法

说明书

本发明提供一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法，能确保小鼠胚胎干细胞在此种培养条件下长期处于自我更新状态且具有多能性。本发明所述的培养基组成成份为小鼠胚胎干细胞基础培养基，含10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L‑Glutamin，0.1mMβ‑巯基乙醇和1mM丙酮酸钠，同时添加Spautin‑1+PD0325901或Spautin‑1+CHIR99021任意组合。与传统添加LIF培养基相比，本发明的新型培养条件减少了外源性动物源性细胞因子的添加，且能达到稳定的培养效果。本发明所摸索出的培养条件，可以为改善和提高目前小鼠胚胎干细胞，同时为优化他种类型的干细胞的培养条件提供了线索。

技术领域

本发明涉及一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)来源于植入前囊胚期的内细胞团，体积小，形态与早期胚胎细胞相似，细胞核大，在体外抑制分化培养，细胞排列紧密，细胞边缘清晰，呈集落状生长。在体外培养条件下能够无限增殖(自我更新)，且在一定条件下能够被诱导分化为神经细胞、造血干细胞、内皮层细胞等几乎所有细胞类型(多能性)。因此，胚胎干细胞常作为研究动物细胞组织分化、胚胎发生、细胞信号网络调控等发育生物学基础研究的一个非常有用的工具。胚胎干细胞体外培养条件下的自我更新能力保证了干细胞研究和应用所需要的大量细胞，而多能性扩展了干细胞在多领域的应用前景和价值。小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs，mESCs)是最早建立的干细胞系，小鼠与人胚胎干细胞(human ESCs，hESCs)拥有众多的相似之处，常作为人类疾病研究的良好模型，解决了研究人胚胎干细胞所带来的伦理道德问题。但人胚胎干细胞体外培养的工序繁琐，成本较高，是目前所要解决的难题。而小鼠胚胎干细胞的体外培养需要特定的营养物质和众多细胞因子的参与，若无这些因子细胞会出现分化现象，从而失去自我更新和多向分化的潜能。所以以小鼠胚胎干细胞为模型，筛选有利于胚胎干细胞体外维持的条件，特别是无动物血清成份的因素(如小分子化合物)，将有助于优化当前不同哺乳动物胚胎干细胞体外维持未分化状态的培养条件。前期我们发现小分子Spautin-1可以促进小鼠胚胎干细胞自我更新的状态，这将为避免小鼠胚胎干细胞在培养过程中出现分化问题提供了一个新途径。

Spautin-1小分子是一种细胞自噬抑制剂，抑制泛素特异性肽酶10(USP10)和USP13的活性.。前期有研究发现Spautin-1通过抑制细胞自噬作用，增强了几种癌症的靶向治疗和传统化学放疗的抗癌活性，因此可以作为一种新型药物，对某些癌症具有潜在治疗意义。

将Spautin-1小分子加入小鼠胚胎干细胞的培养体系，我们发现Spautin-1在最适浓度下，能够在不添加一些细胞因子的条件下短暂地促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。进一步研究发现，仅使用Spautin-1和CHIR99021两种小分子组合或Spautin-1和PD0325901两种小分子组合均可促进小鼠胚胎干细胞自我更新，作为一种干细胞培养的新因素，有望优化未来其他哺乳动物或其他类型干细胞的体外培养条件。

发明内容

本发明所要解决的发现小鼠胚胎干细胞新的培养条件，提供一种小分子在促进小鼠胚胎干细胞自我更新中的应用方法，从而为其他动物的胚胎干细胞培养提供新的策略。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是在含有10％FBS基础上，摸索Spautin-1最适培养浓度，通过加入Spautin-1与CHIR99021两种小分子组合或者Spautin-1与PD0325901两种小分子组合来促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。

本发明的具体操作，包括以下步骤：

(1)取1.5ml 0.1％浓度的明胶包细胞培养板，置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱，包板30min；

(2)取生长密度在70-80％的小鼠胚胎干细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤一次，除去残留的培养液；