[发明专利]一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法

说明书

本发明公开了一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法。包括KMB‑17细胞的传代与计数、病毒收获液制备、疫苗原液制备、疫苗半成品、成品制备。本发明首创在细胞工厂中，以人二倍体细胞为基质规模化制备F基因型腮腺炎病毒减毒活疫苗，在保证疫苗安全性和质量稳定性的同时，还能降低生产成本，节约生产时间。与传统的罗氏瓶培养相比，本发明所需毒种量较小，每批次仅需60～84mL毒种即可获得60000人份的疫苗成品，具有产量大、成本低、质量稳定等优点，对于预防和控制我国流行性腮腺炎的感染和传播具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于抗病毒疫苗制备技术领域，具体是涉及一种以细胞工厂为培养容器，并利用人二倍体细胞(KMB-17株)进行适应性传代培养生长，进而实现规模化制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。

背景技术

腮腺炎病毒(mumps virus，MuV)是引起流行性腮腺炎的病原体。腮腺炎病毒属于副黏病毒科，基因组为不分节段的单负链核糖核酸(RNA)，含有大约15500个核苷酸，在两端序列之间按3′-NP-P-M-F-SH-HN-L-5′的顺序排列着编码7种病毒蛋白的基因。其中，SH基因的变异程度是最大的，因此一般选用SH基因作为分型依据。依据SH抗原上核苷酸的差异，腮腺炎病毒可分为A-L共12个基因型。我国作为一个大量使用腮腺炎减毒活疫苗的地区，但其疫苗毒株除来自国外的成品苗外，主要使用国际通用Jeryl-Lynn株培育得到的S79株，病毒基因型均属于国外流行的A基因型。

随着近年来国内在腮腺炎流行毒株方面的分子流行病学分析的深入，目前在我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。国内外的研究资料表明，虽然不同基因型的腮腺炎减毒活疫苗可针对其它基因型别的腮腺炎病毒产生交叉性抗原保护作用，但这种基因型之间的抗原交叉性是有限的，有时可表现为不能抵抗其它基因型别病毒的感染，从而再次感染腮腺炎病毒。同时，在许多针对该疫苗使用后副反应的分析资料及该病毒的流行病学资料亦提示，某些毒株和基因型具有神经毒性，例如，已报道的资料表明C、D、G、H、I、J基因型具有明确的神经毒性，但F基因型至今尚无报道涉及其神经毒性。因此，从这两个意义上看，针对我国目前腮腺炎流行发病率仍然属于丙类传染病前列的实际情况，分离及研究开发具有主要流行倾向、并具有较好免疫原性的F基因型减毒疫苗毒株，具有重要的现实意义。

同时，目前常规使用的S79株及Jeryl-Lynn株减毒活疫苗均是在鸡胚细胞上制备的，在使用过程中，有引起由于异源性细胞基质所带来过敏反应等副作用的可能。无论从理论上还是应用上看，使用人源性细胞基质的人二倍体细胞进行适应性传代培养生长而制备的腮腺炎减毒株，可以避免采用鸡胚细胞作为细胞基质可能带来的危害，将具有更实际的应用价值。

针对上述问题，本申请人已经有过关于《F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途》和《一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗及其制备方法和应用》的专利申请。前者，主要涉及的是减毒毒种的研究，包括了毒种的制备、毒种减毒性状的观察、毒种免疫原性的分析、安全性分析及种子库的建立。通过收集发生在云南省红河州石屏县牛街镇他腊希望小学学生群体中的腮腺炎患儿咽漱液，采用Vero细胞从腮腺炎患儿咽漱液标本中分离腮腺炎病毒，经RT-PCR方法全基因测序后，明确其为当前流行基因型——F基因型。之后将该分离毒种适应于人二倍体细胞(KMB-17株)并进行蚀斑克隆及减毒传代，得到F基因型腮腺炎减毒毒种——SP-A株。并按国家及WHO相关规程要求对其进行了全面的检定，明确SP-A株具备普通腮腺炎减毒毒种的安全性，并且具有较好的免疫原性。该毒种已与2010年01月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为腮腺炎病毒，保藏编号为CGMCC№.3579。之后又进一步针对该毒种进行了F基因型腮腺炎减毒活疫苗制备工艺的研究，但尚未实现疫苗的规模化生产。

细胞工厂作为一种新型的培养容器，较以往的培养容器具有操作便捷、使用安全、产量高、占用空间少、可控性好、可有效降低污染等优点，且操作方式既优于转瓶，又无生物反应器等类似设备的应用限制，已成为较成熟的新一代细胞培养技术。但现有技术中尚未见有同时利用细胞工厂和人二倍体细胞，实现F基因型腮腺炎减毒活疫苗规模化制备的相关报道。