[发明专利]一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液

说明书

本发明提供一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液。所述缓冲液包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液150‑250 mM/L、氯化钾90‑110mM/L、六水氯化镁30‑40 mM/L、硫酸铵80‑90 mM/L、二甲基亚砜2‑3wt.%、甘油2‑3wt.%、吐温‑20 0.05‑0.2%V/V、聚乙二醇辛基苯基醚0.03‑0.05%V/V、牛血清白蛋白0.3‑0.4%V/V、甲酰胺0.4‑0.6wt.%、甜菜碱450‑550mM/L。在特制的buffer中增加了多种TTH DNA酶的保护剂，使得TTH DNA酶可以发挥更强的扩增性和检测灵敏性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Paillomavirus,HPV），属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，含有约7900 对碱基(bp)，共有3 个基因区组成，包括早期区(Early Region，E 区)、晚期区(Late Region，L 区) 区和与非编码区(UncodingRegion，UCR) 或上游调控区(URR)。E 区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4 和E5 共7 个基因，参与病毒DNA 的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6 和E7 是HPV 的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

实时荧光PCR技术是近年来应用最广泛的一种分子检测技术，由于检测方法简单快捷、灵敏高特异强，进而被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。当PCR扩增时加入特异性的荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，随着PCR反应的进行，被仪器检测到的荧光信号越来越强，结合软件可以对产物进行分析，根据标准曲线得到待测模板的初始浓度，从而达到定量的目的。

荧光定量PCR技术的反应组分体系包括：含荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、TTHDNA 酶液、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP。TTH DNA 酶为通过基因表达方法得到的一种活性蛋白，TTH DNA聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应，形成双链DNA，同时该酶也具有5′→3′外切酶活性。与Taq DNA polymerase 相比，对GC含量高的目的片段及粗样品的扩增效率更为出色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于荧光定量PCR中TTHDNA酶扩增的缓冲液，能够提高TTH DNA 酶扩增效率的buffer。

为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

所述缓冲液包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液150-250 mM/L、氯化钾 90-110mM/L、六水氯化镁30-40 mM/L、硫酸铵80-90 mM/L、二甲基亚砜2-3wt.%、甘油2-3wt.%、吐温-20 0.05-0.2% V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚0.03-0.05% V/V、牛血清白蛋白0.3-0.4%V/V、甲酰胺0.4-0.6wt.%、甜菜碱450-550mM/L。

优选的，所述缓冲液包括如下终浓度的原料：Tris-HCl缓冲液200mM/L、氯化钾102mM/L、氯化钾镁34.3mM/L、硫酸铵84.45mM/L、二甲基亚砜2.5wt.%、甘油2.5wt.%、吐温-20 0.1% V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚 0.04% V/V、0.1%牛血清白蛋白 0.4% V/V、甲酰胺0.5wt.%、甜菜碱500mM/L。

Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L。

上述组分称量混合均匀后的缓冲液的pH值为8.8。

本发明的优点在于：